16 марта 2009

Определение изоферментов ЛДГ в моче (по Юркову)

Для количественного определения изоферментов ЛДГ существует ряд методов, основанных на различии в апоферменте изозимов. Применяют методы электрофореза, хроматографии, термической инактивности и др. В клинике наиболее широко используется метод зонального электрофореза на агаровом геле с окрашиванием тетрахолиевыми солями, адсорбция на ДЗАЕ-целлюлозе и термическое инактивирование. Наиболее точны и надежны методы, основанные на электрофоретическом разделении изоферментов [Юрков Ю. А., 1968] на агаровом геле.

Электрофоретическое разделение изоферментов ЛДГ на агаровом геле складывается из нескольких этапов: приготовления агара и реактивов, нанесения исследуемого материала (моча), электрофоретического разделения и окраски изоферментов. Приготовление агара для электрофореза: 10 г сухого агара помещают в колбу и 3 дня промывают в холодной проточной воде. Затем сливают водопроводную воду и агар заливают дистиллированной водой, которую меняют ежедневно в течение 3 дней.

Приготовление мединалвероналового буфера для агара (рН 8,6): 10,32 г. мединала и 1,84 г веронала насыпают в колбу и заливают 50 мл дистиллированной воды. Помещают в водяную баню при температуре 70 °С для растворения. В расплавленную массу агара выливают 500 мл приготовленного буфера и тщательно смешивают. Таким образом получают 1 % агар, который затем профильтровывают и разливают в колбы по 100 мл. Агар быстро застывает при комнатной температуре. Колбы хранят в холодильнике при 4°С.

Последовательно готовят мединал-вероналовый буфер для ванн: 0,32 г мединала и 1,84 г веронала растворяют в 1 л дистиллированной воды. Для приготовления агаровых пластинок заливают в специальную ванночку расплавленный и охлажденный до 40 — 50 °С агар таким образом, чтобы толщина слоя была не более 2 — 3 мм. На застывший агар помещают чистые, обезжиренные в. смеси эфира со спиртом предметные стекла и сверху заливают их вторым слоем агара толщиной 2 мм. Закрывают ванночку крышкой до полного застывания агара, после чего помещают ее в холодильник при температуре 4 °С на 15 — 20 мин.

Лезвием бритвы вырезают предметные стекла с верхним слоем агара и делают надрез, сместив его в сторону анода, так как во время электрофореза первые две фракции движутся к аноду, а три последующие — к катоду. В надрезанную щель шириной 1 мм вставляют заранее приготовленный фитилек из фильтровальной бумаги, для удаления влаги из щели. Пластинки размещают в камере так, чтобы они не касались друг друга. На агаровые пластинки накладывают с обеих сторон в два слоя мостики хроматографической бумаги размером в ширину ванночки. Вынимают из щелей фитильки и в освободившиеся щели пастеровскими пипетками с оплавленными концами осторожно вносят мочу.

Включают выпрямитель в сеть и проводят электрофорез в течение 2 ч. За 30 мин до окончания электрофореза готовят краску для пластинок. Красящая смесь состоит из 50 мл фосфатного буфера (рН 7,4), 3,5 мл лактата натрия (рН 7,0) и 3 мл 0,05 М раствора цианистого натрия. К смеси добавляют дифосфопиридинуклеотид (DPN) и нитроблютетразолий (NBT), а непосредственно перед окрашиванием добавляют в темноте (фенозинметасульфат (ФМС). Предварительно на торсионных весах, за несколько минут до окончания электрофореза взвешивают 25 мг DPN, 15 мг NBT и 2 мг ФМС. Каждую краску высыпают в отдельную пробирку и растворяют в 2 мл дистиллированной воды. Краску выливают в вышеуказанную смесь.

«Детская урология», Н.А. Лопаткин



После окончания электрофореза пластинки перекладывают в специальную камеру для окраски, заливают красящую смесь и инкубируют в термостате 2 ч при 37 °С. Затем сливают смесь и несколько раз тщательно промывают агаровые пластинки дистиллированной водой. Сушку пластинок производят следующим образом: вырезанные по форме пластинки полоски хроматографической бумаги осторожно накладывают на агар, не сдвигая его. На чистую…

Общая активность ЛДГ в моче больных пиелонефритом в среднем достигает 37,5 ± 3,5 единицы Вроб-левского, но какой-либо зависимости ее от формы и степени тяжести пиелонефрита не отмечено. Перспективными для изучения при воспалительных заболеваниях почек являются ферменты малатдегидрогеназа (МДГ) и альдолаза (АЛД). МДГ относится к ферментам цикла Кребса, который катализирует обратимую реакцию окисления яблочной кислоты в…

Исследуемые сыворотки разводят 1:10 с помощью кроличьей сыворотки (в разведении 1:250), подогревают в электрической водяной бане при 54 °С в течение 20 мин (для разрушения комплемента) и охлаждают. Затем к ним добавляют формалинизированные или свежие эритроциты барана из расчета 0,2 мл на 1 мл сыворотки, содержимое пробирки встряхивают и помещают на 30 мин в термостат…

Приготовленные Аг разводят определенным количеством буфера (рН 6,4) и соединяют с раствором формалинизированных и танизированных эритроцитов в таком количестве, чтобы окончательное разведение Аг было 1:10. Установлено, что именно это разведение является оптимальным, так как не дает гемолиза или агглютинации эритроцитов в отсутствие специфической сыворотки. Содержимое колбочек встряхивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 1…

Свежевыпущенную мочу центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин, отсасывают надосадочную жидкость и осадок дважды промывают в изотоническом растворе хлорида натрия с фосфатным буфером (рН 7,3). В отмытый осадок добавляют 0,2 мл разведенной 1:5 люминесцирующей кроличьей сыворотки против глобулинов человека. Осадок мочи вместе с сывороткой инкубируют при 37 °С в течение 30 мин, после…