16 марта 2009

Методика реакции РПГА (по Бойдену)

Исследуемые сыворотки разводят 1:10 с помощью кроличьей сыворотки (в разведении 1:250), подогревают в электрической водяной бане при 54 °С в течение 20 мин (для разрушения комплемента) и охлаждают. Затем к ним добавляют формалинизированные или свежие эритроциты барана из расчета 0,2 мл на 1 мл сыворотки, содержимое пробирки встряхивают и помещают на 30 мин в термостат при 37 °С. Сыворотки с эритроцитами на ночь помещают в холодильник при 4 °С. На следующий день сыворотки отбирают пипеткой, а осадок эритроцитов удаляют.

РПГА проводят в полистироловых пластинках.

В первые лунки наливают по 0,4 мл исследуемых сывороток в разведении 1:10, в последующие лунки — двукратные их разведения до 1:5120.

В каждую лунку добавляют 0,05 мл соответствующего диагностикума — эритроциты барана, сенсибилизированные антигенами (Аг).

РПГА учитывают на следующий день. Полную агглютинацию оценивают + + + +, почти полную + + +. Положительной считают агглютинацию + + + или + + + +. Титры РПГА выражают как эквивалент самого высокого разведения (+ + + или + + + +).

Контролем служат разведения исследуемых сывороток с несенсибилизированными эритроцитами и взвесь сенсибилизированных эритроцитов в кроличьей сыворотке (в разведении 1:250, контроль Аг). Для подтверждения специфичности РПГА ставят реакцию торможения гемагглютинации. К последовательным двукратным разведениям исследуемых сывороток прибавляют соответствующий Аг, встряхивают содержимое пластинок и ставят их на 1 ч в термостат при 37 °С, затем добавляют диагностикум — эритроциты барана, сенсибилизированные соответствующими Аг, и снова встряхивают. В контроле РПГА должна быть отрицательной.

Приготовление Аг для сенсибилизации эритроцитов в РПГА. У всех больных каждые 7 — 10 дней производят посев мочи. Выделенные микробы сохраняют, из их суточных культур готовят Аг. Культуры выращивают на пластинах 1,5% слабощелочного агара.

На следующий день их смывают стерильным изотоническим раствором хлорида натрия (рН 7,0) и доводят до концентрации 10 млрд. микробных тел в 1 мл мочи по оптическому стандарту мутности. Микробные взвеси прогревают в течение 2 ч в кипящей водяной бане и охлаждают. Отсутствие роста высеянной микробной взвеси служит доказательством того, что микробы были убиты. Несколько приготовленных Аг одного вида микробов от разных больных сливают вместе, центрифугируют и надосадочную жидкость используют в качестве Аг.

Для определения антибактериальных антител в сыворотке крови в контрольной группе детей применяют поливалентные Аг бактерий кишечной, синегнойной палочки, протея, энтерококка, белого стафилококка, которые получают сливанием убитых культур микробов от разных больных. Приготовленные Аг до использования хранят в холодильнике.

«Детская урология», Н.А. Лопаткин



Для количественного определения изоферментов ЛДГ существует ряд методов, основанных на различии в апоферменте изозимов. Применяют методы электрофореза, хроматографии, термической инактивности и др. В клинике наиболее широко используется метод зонального электрофореза на агаровом геле с окрашиванием тетрахолиевыми солями, адсорбция на ДЗАЕ-целлюлозе и термическое инактивирование. Наиболее точны и надежны методы, основанные на электрофоретическом разделении изоферментов [Юрков Ю….

После окончания электрофореза пластинки перекладывают в специальную камеру для окраски, заливают красящую смесь и инкубируют в термостате 2 ч при 37 °С. Затем сливают смесь и несколько раз тщательно промывают агаровые пластинки дистиллированной водой. Сушку пластинок производят следующим образом: вырезанные по форме пластинки полоски хроматографической бумаги осторожно накладывают на агар, не сдвигая его. На чистую…

Общая активность ЛДГ в моче больных пиелонефритом в среднем достигает 37,5 ± 3,5 единицы Вроб-левского, но какой-либо зависимости ее от формы и степени тяжести пиелонефрита не отмечено. Перспективными для изучения при воспалительных заболеваниях почек являются ферменты малатдегидрогеназа (МДГ) и альдолаза (АЛД). МДГ относится к ферментам цикла Кребса, который катализирует обратимую реакцию окисления яблочной кислоты в…

Приготовленные Аг разводят определенным количеством буфера (рН 6,4) и соединяют с раствором формалинизированных и танизированных эритроцитов в таком количестве, чтобы окончательное разведение Аг было 1:10. Установлено, что именно это разведение является оптимальным, так как не дает гемолиза или агглютинации эритроцитов в отсутствие специфической сыворотки. Содержимое колбочек встряхивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 1…

Свежевыпущенную мочу центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин, отсасывают надосадочную жидкость и осадок дважды промывают в изотоническом растворе хлорида натрия с фосфатным буфером (рН 7,3). В отмытый осадок добавляют 0,2 мл разведенной 1:5 люминесцирующей кроличьей сыворотки против глобулинов человека. Осадок мочи вместе с сывороткой инкубируют при 37 °С в течение 30 мин, после…