16 марта 2009

Приготовление диагностикумов

Приготовленные Аг разводят определенным количеством буфера (рН 6,4) и соединяют с раствором формалинизированных и танизированных эритроцитов в таком количестве, чтобы окончательное разведение Аг было 1:10. Установлено, что именно это разведение является оптимальным, так как не дает гемолиза или агглютинации эритроцитов в отсутствие специфической сыворотки.

Содержимое колбочек встряхивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч при непрерывном встряхивании. Сенсибилизированные таким образом эритроциты отмывают буфером (рН 7,2) для удаления несвязанного Аг, затем ресуспендируют в первоначальном их объеме и хранят в холодильнике до использования.

Перед применением в РПГА диагностикум проверяют следующим способом. В лунки полистироловых пластинок наливают по 0,4 мл кроличьей сыворотки (1:250) и добавляют приготовленные диагностикумы в количестве 0,05 мл. Реакция должна быть отрицательной. В другие лунки наливают 0,4 мл кроличьей сыворотки против того или иного микроба, подогретой и адсорбированной формалинизированными эритроцитами, как и нормальная кроличья сыворотка. РПГА должна быть в титре, соответствующем титру иммунной кроличьей сыворотки. Для контроля также проводят РТГА. Активность диагностикумов проверяют путем их титрования с иммунной сывороткой, полученной при иммунизации кроликов микроорганизмами, выделенными из мочи больных.

В последние годы с целью упрощения серологической диагностики пиелонефрита и для исключения трудностей, связанных с приготовлением Аг из аутоштаммов мочи, предложено использовать поливалентный Аг, включающий сумму Аг из восьми серотипов, чаще изолируемых из мочи больных пиелонефритом: О1; О2; О4; О6; О7; О8; О18; О75 [Andersen Н., 1976]. Клиническое испытание этого Аг и РПГА с параллельным использованием ауто-Аг дало примерно одинаковые результаты [Глезеров В. 3., Сивочуб М. И., 1976; Andersen H., 1967], что позволяет рекомендовать данное исследование для практического использования.

Для топической диагностики инфекции мочевых путей заслуживает большого внимания новый метод, предложенный J. Tomas и соавт. (1974) и заключающийся в определении в моче бактерий, покрыт Ат (БПА-тест).

Необходимость дифференцировать два уровня поражения мочевой системы (пиелонефрит и цистит) постоянно возникает в детской нефроурологической практике, поэтому тест БПА привлекает внимание клиницистов.

Данный метод основан на выявлении иммуноглобулиновой оболочки бактерий. Синтез Ат (IgM), как ясно из изложенного выше, осуществляется главным образом в ткани почек. Соединение бактерий с Ат происходит в очаге поражения, поэтому при пиелонефрите в моче появляются бактерии, покрытые Ат, а при цистите этого не происходит.

Метод основан на взаимодействии Аг с Ат. В данной реакции Аг являются Ат (IgM), покрывающими бактерии, которые соединяются со специфическими Ат кролчьими анти-Ig-сыворотками, окрашенными флюорохромом, БПА определяют реакцией иммунофлюоресценции (РИФ). В литературе последних лет пока имеются единичные работы, посвященные клиническому испытанию данного метода [Кальтянис П. А., Даубарас Г. Б., 1979; Теблоева Л. Т. и др., 1980; J. Thomas et al., 1974; S. Silverberge et al., 1976; Denis R. et al., 1979].

Исследованиями Л. Т. Теблоевой и М. Б. Цванг установлена хорошая корреляция теста БПА с клинико-лабораторными и инструментальными исследованиями. При остром и хроническом пиелонефрите положительные результаты выявлены почти у 80%, при цистите — у 11 % обследованных. Не подлежит сомнению, что простой и безопасный для больного тест БПА заслуживает более широкого внедрения. Дальнейшие исследования с использованием антисывороток к отдельным классам позволяет установить принадлежность местносинтезируемых Ат к тому или иному классу

«Детская урология», Н.А. Лопаткин

Читайте далее:



Исследуемые сыворотки разводят 1:10 с помощью кроличьей сыворотки (в разведении 1:250), подогревают в электрической водяной бане при 54 °С в течение 20 мин (для разрушения комплемента) и охлаждают. Затем к ним добавляют формалинизированные или свежие эритроциты барана из расчета 0,2 мл на 1 мл сыворотки, содержимое пробирки встряхивают и помещают на 30 мин в термостат…

Свежевыпущенную мочу центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин, отсасывают надосадочную жидкость и осадок дважды промывают в изотоническом растворе хлорида натрия с фосфатным буфером (рН 7,3). В отмытый осадок добавляют 0,2 мл разведенной 1:5 люминесцирующей кроличьей сыворотки против глобулинов человека. Осадок мочи вместе с сывороткой инкубируют при 37 °С в течение 30 мин, после…

Для количественного определения изоферментов ЛДГ существует ряд методов, основанных на различии в апоферменте изозимов. Применяют методы электрофореза, хроматографии, термической инактивности и др. В клинике наиболее широко используется метод зонального электрофореза на агаровом геле с окрашиванием тетрахолиевыми солями, адсорбция на ДЗАЕ-целлюлозе и термическое инактивирование. Наиболее точны и надежны методы, основанные на электрофоретическом разделении изоферментов [Юрков Ю….

После окончания электрофореза пластинки перекладывают в специальную камеру для окраски, заливают красящую смесь и инкубируют в термостате 2 ч при 37 °С. Затем сливают смесь и несколько раз тщательно промывают агаровые пластинки дистиллированной водой. Сушку пластинок производят следующим образом: вырезанные по форме пластинки полоски хроматографической бумаги осторожно накладывают на агар, не сдвигая его. На чистую…

Общая активность ЛДГ в моче больных пиелонефритом в среднем достигает 37,5 ± 3,5 единицы Вроб-левского, но какой-либо зависимости ее от формы и степени тяжести пиелонефрита не отмечено. Перспективными для изучения при воспалительных заболеваниях почек являются ферменты малатдегидрогеназа (МДГ) и альдолаза (АЛД). МДГ относится к ферментам цикла Кребса, который катализирует обратимую реакцию окисления яблочной кислоты в…