16 марта 2009

Методика определения БПА

Свежевыпущенную мочу центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин, отсасывают надосадочную жидкость и осадок дважды промывают в изотоническом растворе хлорида натрия с фосфатным буфером (рН 7,3). В отмытый осадок добавляют 0,2 мл разведенной 1:5 люминесцирующей кроличьей сыворотки против глобулинов человека. Осадок мочи вместе с сывороткой инкубируют при 37 °С в течение 30 мин, после чего вновь дважды отмывают тем же раствором.

Мазки готовят на обезжиренных предметных стеклах и проводят фазово-контрастную микроскопию осадка мочи с подсчетом числа микробных клеток. После этого мазки исследуют под люминесцентным микроскопом ЛЮМАМ-И1 в сине-фиолетовом свете с помощью объектива 90 и окуляра 7 с иммерсионным нелюминесцирующим маслом (светофильтры БС-8-3, ФС 1-4, СЗС24,4). Просматривают не менее 200 полей зрения. Время исследования составляет 4 — 5 мин. Положительной считается реакция при наличии свечения не менее 25% бактерий.

Для дифференциальной диагностики хронического пиелонефрита и цистита широко стала использоваться реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ).

Методика РБТЛ. Для РБТЛ используют метод Пермина и Линга с некоторыми изменениями [Pearmin, 1963; Ling К., 1963]. В асептических условиях берут. 10 мл венозной крови в стерильную пробирку, в которую предварительно добавляют 0,5 мл раствора гепарина, разведенного в 10 раз, а затем, с целью осаждения эритроцитов, 1% раствор желатина. Пробирку помещают в термостат при температуре 37 °С на 15 — 20 мин.

В отстоявшейся плазме определяют количество лейкоцитов в 1 мл (в камере Горяева). Плазму разливают в четырехугольные бутылочки-флаконы объемом 50 мл с таким расчетом, чтобы в каждом флаконе было 10 000 000 лейкоцитов. Средой для культивирования является среда № 199, лейкоциты человека в этой среде хорошо растут и стимулируются. Оптимальное содержание плазмы в культуральной среде составляет 15 — 20. Используют аутологичную плазму, так как гетерологичная может обладать неспецифической стимуляцией, иногда довольно значительной.

Среду № 199 добавляют во флаконы в таком количестве, чтобы общий объем культуры составил 4,9 мл, а в контрольном флаконе — 5 мл. Антибиотики к среде не добавляют. В опытный флакон вносят 0,1 мл ФГА. Следовательно, объем культуры, так же как в контроле, составляет 5 мл.

Инкубацию проводят в термостате при температуре 37 °С в течение 3 сут (72 ч). По окончании культивирования клетки, растущие на стенке флакона, переводят во взвесь, которую сливают в центрифужные пробирки и центрифугируют со скоростью 500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, из клеточного осадка готовят мазки, которые после фиксации в метиловом спирте окрашивают по Романовскому — Гимзе. В полученных мазках под микроскопом подсчитывают количество бластов (большие клетки с пиронинофильной цитоплазмой, крупным ядром и выраженными ядрышками). Количество бластов выражают в процентах.

«Детская урология», Н.А. Лопаткин



Для количественного определения изоферментов ЛДГ существует ряд методов, основанных на различии в апоферменте изозимов. Применяют методы электрофореза, хроматографии, термической инактивности и др. В клинике наиболее широко используется метод зонального электрофореза на агаровом геле с окрашиванием тетрахолиевыми солями, адсорбция на ДЗАЕ-целлюлозе и термическое инактивирование. Наиболее точны и надежны методы, основанные на электрофоретическом разделении изоферментов [Юрков Ю….

После окончания электрофореза пластинки перекладывают в специальную камеру для окраски, заливают красящую смесь и инкубируют в термостате 2 ч при 37 °С. Затем сливают смесь и несколько раз тщательно промывают агаровые пластинки дистиллированной водой. Сушку пластинок производят следующим образом: вырезанные по форме пластинки полоски хроматографической бумаги осторожно накладывают на агар, не сдвигая его. На чистую…

Общая активность ЛДГ в моче больных пиелонефритом в среднем достигает 37,5 ± 3,5 единицы Вроб-левского, но какой-либо зависимости ее от формы и степени тяжести пиелонефрита не отмечено. Перспективными для изучения при воспалительных заболеваниях почек являются ферменты малатдегидрогеназа (МДГ) и альдолаза (АЛД). МДГ относится к ферментам цикла Кребса, который катализирует обратимую реакцию окисления яблочной кислоты в…

Исследуемые сыворотки разводят 1:10 с помощью кроличьей сыворотки (в разведении 1:250), подогревают в электрической водяной бане при 54 °С в течение 20 мин (для разрушения комплемента) и охлаждают. Затем к ним добавляют формалинизированные или свежие эритроциты барана из расчета 0,2 мл на 1 мл сыворотки, содержимое пробирки встряхивают и помещают на 30 мин в термостат…

Приготовленные Аг разводят определенным количеством буфера (рН 6,4) и соединяют с раствором формалинизированных и танизированных эритроцитов в таком количестве, чтобы окончательное разведение Аг было 1:10. Установлено, что именно это разведение является оптимальным, так как не дает гемолиза или агглютинации эритроцитов в отсутствие специфической сыворотки. Содержимое колбочек встряхивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 1…