13 марта 2009

Определение активности ЛДГ в моче (по Леви)

Для исследования используют утреннюю порцию мочи. С целью очищения мочи от ингибиторов мочу подвергают диализу в коллодиевых или целлофановых мешочках. Для диализа можно использовать дистиллированную воду, фосфатные буферы или проточную водопроводную воду.

Для определения общей активности мочевой ЛДГ необходимы следующие реактивы: фосфатный буфер (рН 7,2) Ма2НРО4 * 0,8 мл 1/ 15 К2Н2РО4 (72 мл), пируват натрия 4,1 * 10-3 М (0,45 мг пирувата на 1 мл фосфатного буфера), НАДН2 10,6 * 10-3 М (8,3 мг на 1 мл буфера), 1 М НС1, 1 М NaOH, индикаторная бумага (химические реактивы готовят непосредственно перед проведением исследования).

В течение 15 мин при 3000 об/мин центрифугируют 10 мл мочи. Надосадочную жидкость сливают в другую центрифужную пробирку и в ней с помощью индикаторной бумаги определяют рН. Осторожным добавлением капли НС1 или NaOH (в зависимости от исходной реакции мочи) доводят рН мочи до 7,2.

Затем жидкость подвергают центрифугированию в рефрижераторной центрифуге при 4 °С и 10 000 об/мин в течение 30 мин. Затем мочу диализируют в течение 80 мин. К 0,1 мл диализата добавляют 2850 мм Sodium pyruvate и 50 мм КаДН2. Смесь в пробирке тщательно смешивают и выливают в кювету спектрофотометра, после чего регистрируют оптическую плотность определяемого раствора (отечественный спектрофотометр СФ-4 или СФД-2 с использованием УСФ-2).

Расчет ведут по формуле: E=((a-b)*10*1000)/30,

где:

  • а — оптическая плотность раствора до инкубации; 
  • b — после инкубации;
  • 10 — коэффициент пересчета на 1 мл мочи;
  • 1000 — коэффициент перевода в единицы Вроблевского;
  • 30 — время инкубации (мин).

«Детская урология», Н.А. Лопаткин



Для количественного определения изоферментов ЛДГ существует ряд методов, основанных на различии в апоферменте изозимов. Применяют методы электрофореза, хроматографии, термической инактивности и др. В клинике наиболее широко используется метод зонального электрофореза на агаровом геле с окрашиванием тетрахолиевыми солями, адсорбция на ДЗАЕ-целлюлозе и термическое инактивирование. Наиболее точны и надежны методы, основанные на электрофоретическом разделении изоферментов [Юрков Ю….

После окончания электрофореза пластинки перекладывают в специальную камеру для окраски, заливают красящую смесь и инкубируют в термостате 2 ч при 37 °С. Затем сливают смесь и несколько раз тщательно промывают агаровые пластинки дистиллированной водой. Сушку пластинок производят следующим образом: вырезанные по форме пластинки полоски хроматографической бумаги осторожно накладывают на агар, не сдвигая его. На чистую…

Общая активность ЛДГ в моче больных пиелонефритом в среднем достигает 37,5 ± 3,5 единицы Вроб-левского, но какой-либо зависимости ее от формы и степени тяжести пиелонефрита не отмечено. Перспективными для изучения при воспалительных заболеваниях почек являются ферменты малатдегидрогеназа (МДГ) и альдолаза (АЛД). МДГ относится к ферментам цикла Кребса, который катализирует обратимую реакцию окисления яблочной кислоты в…

Исследуемые сыворотки разводят 1:10 с помощью кроличьей сыворотки (в разведении 1:250), подогревают в электрической водяной бане при 54 °С в течение 20 мин (для разрушения комплемента) и охлаждают. Затем к ним добавляют формалинизированные или свежие эритроциты барана из расчета 0,2 мл на 1 мл сыворотки, содержимое пробирки встряхивают и помещают на 30 мин в термостат…

Приготовленные Аг разводят определенным количеством буфера (рН 6,4) и соединяют с раствором формалинизированных и танизированных эритроцитов в таком количестве, чтобы окончательное разведение Аг было 1:10. Установлено, что именно это разведение является оптимальным, так как не дает гемолиза или агглютинации эритроцитов в отсутствие специфической сыворотки. Содержимое колбочек встряхивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 1…