19 апреля 2012

Тонкослойная хроматография и хроматография

С помощью двумерной тонкослойной хроматографии и хроматографии на катионообменнике показано, что белок VP1 содержит набор уникальных пептидов, отсутствующих в белках VP2 и VP3. В белках VP2 и VP3 обнаружено несколько идентичных пептидов, хотя в целом пептидные профили этих белков различны.

На этом основании делается вывод о наличии в вирусном капсиде трех различных белков: VP1, VP2 и VP3 (Fey, Hirt, 1975). При сравнении триптических пептидов методом фингерпринта оказалось, что по структуре VP1 и VP2 вируса полиомы различны, VP2 и VP3 имеют много общего (Wheeler et al., 1977).

Вирусы SV40 и PY антигенно различны. Гомологии между их вирусными ДНК, а также ДНК этих двух вирусов и вируса Шоупа не обнаружено. В отличие от SV40 вирус полиомы обладает гемагглютинирующими свойствами.

Показано, что полимеризованный белок VP1 характеризуется такой же гемагглютинирующей активностью, что и интактный вирус (Walter, Deppert, 1975).

Единственным ферментом, пока обнаруженным в составе вирионов полиомы и SV40, является эндонуклеаза, вероятно, непосредственно участвующая в процессах рекомбинации и интеграции вирусных геномов с клеточной ДНК.

Эндонуклеазная активность, содержащаяся в очищенных вирионах PY и SV40, требует наличия Mg2+ и Са2+ в оптимальной концентрации 5 — 7ммоль Мg2+ в той же концентрации в 2 раза активнее. Оптимум действия рН 7,5 — 8,5; фермент стабилен при длительном хранении при — 20 °С, но на 65% инактивируется после прогревания при 70 °С.

Активность в градиенте плотности CsCl ассоциируется как с полными вирусными частицами, так и пустыми оболочками. Эндонуклеаза нейтрализуется антисывороткой против SV40.

Для проявления активности фермента не требовалось введения в систему детергентов. Показано, что после короткого контакта эндонуклеазы с ДНК I в обеих полинуклеотидных нитях возникают отдельные разрывы, а при более длительной экспозиции образуются более короткие фрагменты ДНК.

Вирусная ДНК И расщепляется эндонуклеазой с меньшей (приблизительно в 4 раза) скоростью, чем супер-спиральная ДНК I. Ковалштнозам1Кнутая, но не супер-циркулярная ДНК также расщепляется в 5 раз медленнее, чем ДНК I. Денатурированная ДНК расщепляется с такой же скоростью, как и ДНК I.

B специальной работе Rouget и соавт. (1976) исследовали два типа вирусных частиц: полученные из культуральной жидкости и клеток (препарат 1), выделенные только из клеток (препарат 2). Частицы подвергали одинаковым процедурам очистки, включая центрифугирование в градиенте плотности CsCl.

Эндонуклеазную активность тестировали в системе, содержащей 10 ммоль трис рН 7,4, 5 ммоль MgCl2, 5 ммоль СаСl, 1—10 мкг ДНК на 1 мл и 5 —10 мкг вирусного белка. В качестве субстрата использовали суперциркулярную вирусную ДНК.

Оказалось, что при действии препарата 1 ДНКI исчезает и превращается во фрагменты, размер которых меньше одного геномного эквивалента (по данным центрифугирования в щелочном градиенте сахарозы). В нейтральных градиентах сахарозы такая ДНК седиментирует как циркулярная молекула с разрывом в отдельных цепях.

Если же использовали препарат 2, то по данным центрифугирования в нейтральных и щелочных градиентах сахарозы в молекуле ДНК возникает только один разрыв сразу в обеих нитях и образуется линейная молекула, соответствующая полному геному.

Ферментативные активности в препаратах 1 и 2 отличаются также по величине Км и тем, что фермент препарата 2 высокочувствителен к Са2+.

Активность препарата 2 возрастала в присутствии дезоксихолата.

Установлено, что фермент препарата 2 разрывает ДНК вируса SV40 в одном из двух возможных участков, обогащенных по А — Т, т. е., вероятно, его действие аналогично действию нуклеазы SI.

Если продукт переваривания ферментом из препарата 2 подвергали дальнейшей обработке рестриктазой из Е. coli RI, то обнаруживались 4 фрагмента, имеющих размер 0,87; 0,62; 0,33 и 0,10 от размера полного генома (Rouget et al., 1976).


«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Установлено, что продуктивная инфекция и трансформация клеток под действием ДНК-содержащих онковирусов обычно взаимоисключают друг друга: клетки природного хозяина главным образом продуктивно инфицируются (пермиссивные клетки), в то время как клетки другого вида чаще трансформируются (непермиссивные клетки). Однако не всегда пермиссивность обусловливается «природной» клеточной системой, иногда онковирусы могут обладать довольно широким спектром цитопатогенного действия на клетки других…

Вирус Эпштейна — Барр (ВЭБ) систематически продуцируется клетками африканской лимфомы Беркитта в культуре и обнаруживается при электронно-микроскопическом исследовании. В небольшом проценте случаев ВЭБ синтезируют клетки лимфобластоидных линий. В некоторых клеточных линиях и биопсийном материале из лимфом Беркитта вирионы ВЭБ не определяются. По-видимому, синтез полных вирусных частиц начинается после эксплантации клеток лимфомы в культуру, что сопровождается…

В лимфобластных клетках, несущих геном ВЭБ, синтезируется не менее 4 групп белков, ассоциированных с вирусом: Ядерный антиген (ЭBNA), по-видимому, аналогичен Т-антигену папова- и аденовирусов. Он обнаруживается с помощью РСК. Однако в отличие от Т-антигена папова- и аденовирусов ЭБНА прочно связан с хроматином и не отделяется от хромосом в процессе митоза (Luka et al., 1977).  Химическая…

В обширных сероэпидемиологических исследованиях установлено, что высокие титры антител к ВЭБ чаще всего выявляются при двух злокачественных новообразованиях человека — лимфоме Беркитта и НФК, для которых характерно особое географическое распространение. Лимфома Беркитта встречается преимущественно в определенных районах экваториальной Африки и Новой Гвинеи, а карцинома носоглотки — наиболее частая злокачественная опухоль населения в некоторых областях Южного…

Вирус герпеса саймири выделен из почечной культуры здоровой беличьей обезьяны, а вирус герпеса ателес — от здоровых паукообразных обезьян. Для обоих вирусов фибробласты и эпителиальные клетки обезьян являются пермиссивной системой, в ней вирусы размножаются с цитопатогенным эффектом и могут быть получены в больших количествах. Оба вируса распространяются горизонтально и очень широко охватывают популяции природных хозяев,…