Тонкослойная хроматография и хроматография

С помощью двумерной тонкослойной хроматографии и хроматографии на катионообменнике показано, что белок VP1 содержит набор уникальных пептидов, отсутствующих в белках VP2 и VP3. В белках VP2 и VP3 обнаружено несколько идентичных пептидов, хотя в целом пептидные профили этих белков различны.

На этом основании делается вывод о наличии в вирусном капсиде трех различных белков: VP1, VP2 и VP3 (Fey, Hirt, 1975). При сравнении триптических пептидов методом фингерпринта оказалось, что по структуре VP1 и VP2 вируса полиомы различны, VP2 и VP3 имеют много общего (Wheeler et al., 1977).

Вирусы SV40 и PY антигенно различны. Гомологии между их вирусными ДНК, а также ДНК этих двух вирусов и вируса Шоупа не обнаружено. В отличие от SV40 вирус полиомы обладает гемагглютинирующими свойствами.

Показано, что полимеризованный белок VP1 характеризуется такой же гемагглютинирующей активностью, что и интактный вирус (Walter, Deppert, 1975).

Единственным ферментом, пока обнаруженным в составе вирионов полиомы и SV40, является эндонуклеаза, вероятно, непосредственно участвующая в процессах рекомбинации и интеграции вирусных геномов с клеточной ДНК.

Эндонуклеазная активность, содержащаяся в очищенных вирионах PY и SV40, требует наличия Mg²⁺ и Са²⁺ в оптимальной концентрации 5 — 7ммоль Мg²⁺ в той же концентрации в 2 раза активнее. Оптимум действия рН 7,5 — 8,5; фермент стабилен при длительном хранении при — 20 °С, но на 65% инактивируется после прогревания при 70 °С.

Активность в градиенте плотности CsCl ассоциируется как с полными вирусными частицами, так и пустыми оболочками. Эндонуклеаза нейтрализуется антисывороткой против SV40.

Для проявления активности фермента не требовалось введения в систему детергентов. Показано, что после короткого контакта эндонуклеазы с ДНК I в обеих полинуклеотидных нитях возникают отдельные разрывы, а при более длительной экспозиции образуются более короткие фрагменты ДНК.

Вирусная ДНК И расщепляется эндонуклеазой с меньшей (приблизительно в 4 раза) скоростью, чем супер-спиральная ДНК I. Ковалштнозам1Кнутая, но не супер-циркулярная ДНК также расщепляется в 5 раз медленнее, чем ДНК I. Денатурированная ДНК расщепляется с такой же скоростью, как и ДНК I.

B специальной работе Rouget и соавт. (1976) исследовали два типа вирусных частиц: полученные из культуральной жидкости и клеток (препарат 1), выделенные только из клеток (препарат 2). Частицы подвергали одинаковым процедурам очистки, включая центрифугирование в градиенте плотности CsCl.

Эндонуклеазную активность тестировали в системе, содержащей 10 ммоль трис рН 7,4, 5 ммоль MgCl₂, 5 ммоль СаСl, 1—10 мкг ДНК на 1 мл и 5 —10 мкг вирусного белка. В качестве субстрата использовали суперциркулярную вирусную ДНК.

Оказалось, что при действии препарата 1 ДНКI исчезает и превращается во фрагменты, размер которых меньше одного геномного эквивалента (по данным центрифугирования в щелочном градиенте сахарозы). В нейтральных градиентах сахарозы такая ДНК седиментирует как циркулярная молекула с разрывом в отдельных цепях.

Если же использовали препарат 2, то по данным центрифугирования в нейтральных и щелочных градиентах сахарозы в молекуле ДНК возникает только один разрыв сразу в обеих нитях и образуется линейная молекула, соответствующая полному геному.

Ферментативные активности в препаратах 1 и 2 отличаются также по величине Км и тем, что фермент препарата 2 высокочувствителен к Са²⁺.

Активность препарата 2 возрастала в присутствии дезоксихолата.

Установлено, что фермент препарата 2 разрывает ДНК вируса SV40 в одном из двух возможных участков, обогащенных по А — Т, т. е., вероятно, его действие аналогично действию нуклеазы SI.

Если продукт переваривания ферментом из препарата 2 подвергали дальнейшей обработке рестриктазой из Е. coli RI, то обнаруживались 4 фрагмента, имеющих размер 0,87; 0,62; 0,33 и 0,10 от размера полного генома (Rouget et al., 1976).

«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко