13 марта 2009

Определение аминокислот в моче (методика)

К 0,2 мл негомолизированной сыворотки добавляют 0,4 мл ацетона, осторожно смешивают стеклянной палочкой, после чего центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Центрифугируют 10 мл мочи и наносят на хроматографическую бумагу («ленинградская медленная») центрифугат без дальнейшей обработки.

На полосу хроматографической бумаги с помощью циркуля наносят окружность диаметром 3 см (диски). На диски наносят микропипеткой 0,05 мл центрифугата, высушивают на воздухе и окрашивают 0,5% раствором нингидрина (полоску бумаги 1 — 2 раза погружают в раствор красителя), после чего полоски бумаги сушат на воздухе 12 — 15 мин, затем помещают на 15 мин в сушильный шкаф при температуре 60 С для выявления окраски. Сравнивают полученную окраску со стандартной шкалой.

Для получения шкалы делают 5 разведений стандартного раствора с концентрацией азота глицина: 19,9; 9,9; 4,9; 2,5 и 1,2 ммоль (28, 14, 7, 3,5 и 1,75 мг%) и проводят с ними все те же манипуляции, что и с центрифугатом.

Полученное окрашивание можно измерить также путем элюции окрашенных дисков. Разрезанные диски помещают в пробирки или сахарные стаканчики, заливают 3 мл этилового спирта и в каждую пробу вводят по 1 капле ледяной уксусной кислоты. Выдерживают 30 мин, после чего фотометрируют на ФЭК при длине волны 500 — 560 нм с зеленым фильтром в кюветах с рабочим расстоянием 0,5 см против контроля. Для контроля элюируют чистый диск. В норме содержание азота аминокислот в крови у новорожденных и детей грудного возраста составляет 5,35 — 6,78 ммоль/л, у более старших детей — 3,21 — 5,35 ммоль/л.

Выделение азота аминокислот с мочой преобладает у детей грудного возраста (4 — 5 мг/кг и более), после года показатели идентичны таковым у взрослых (2 — 2,5 мг/кг).

Для суждения о характере, распространенности и локализации патологического процесса большое значение приобретает определение концентрации отдельных аминокислот в крови и моче.

С этой целью применяют методы разделения аминокислот на фильтровальной бумаге, метод высоко-вольтного электрофореза, хроматографию аминокислот на колонке ионообменных смол, метод газовой хроматографии и др. Предложены комбинированные методы с одновременным использованием электрофореза и хроматографии. Наиболее распространена хроматография по Пасхиной, позволяющая разделить до 17 аминокислот.

Аминокислотный спектр меняется в зависимости от возраста — у новорожденных и у детей в первые месяцы жизни отмечаются высокие показатели экскреции аминокислот (глицин, серии, аспарагин, лизин, гистидин, треонин, пролин и др.). Отношение клиренса аминокислот к клиренсу креатинина у грудных детей равно 1,26 — 5,28, у детей старше 2 лет — 0,96 — 2,44. Представленные данные свидетельствуют о физиологической тубулопатии у детей раннего возраста, что указывает на несовершенство транспортных систем почечных канальцев для аминокислот и о чем следует помнить при диагностике первичных тубулопатии [Вельтищев Ю. Е. и др., 1979].

«Детская урология», Н.А. Лопаткин



Для количественного определения изоферментов ЛДГ существует ряд методов, основанных на различии в апоферменте изозимов. Применяют методы электрофореза, хроматографии, термической инактивности и др. В клинике наиболее широко используется метод зонального электрофореза на агаровом геле с окрашиванием тетрахолиевыми солями, адсорбция на ДЗАЕ-целлюлозе и термическое инактивирование. Наиболее точны и надежны методы, основанные на электрофоретическом разделении изоферментов [Юрков Ю….

После окончания электрофореза пластинки перекладывают в специальную камеру для окраски, заливают красящую смесь и инкубируют в термостате 2 ч при 37 °С. Затем сливают смесь и несколько раз тщательно промывают агаровые пластинки дистиллированной водой. Сушку пластинок производят следующим образом: вырезанные по форме пластинки полоски хроматографической бумаги осторожно накладывают на агар, не сдвигая его. На чистую…

Общая активность ЛДГ в моче больных пиелонефритом в среднем достигает 37,5 ± 3,5 единицы Вроб-левского, но какой-либо зависимости ее от формы и степени тяжести пиелонефрита не отмечено. Перспективными для изучения при воспалительных заболеваниях почек являются ферменты малатдегидрогеназа (МДГ) и альдолаза (АЛД). МДГ относится к ферментам цикла Кребса, который катализирует обратимую реакцию окисления яблочной кислоты в…

Исследуемые сыворотки разводят 1:10 с помощью кроличьей сыворотки (в разведении 1:250), подогревают в электрической водяной бане при 54 °С в течение 20 мин (для разрушения комплемента) и охлаждают. Затем к ним добавляют формалинизированные или свежие эритроциты барана из расчета 0,2 мл на 1 мл сыворотки, содержимое пробирки встряхивают и помещают на 30 мин в термостат…

Приготовленные Аг разводят определенным количеством буфера (рН 6,4) и соединяют с раствором формалинизированных и танизированных эритроцитов в таком количестве, чтобы окончательное разведение Аг было 1:10. Установлено, что именно это разведение является оптимальным, так как не дает гемолиза или агглютинации эритроцитов в отсутствие специфической сыворотки. Содержимое колбочек встряхивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 1…