31 марта 2009

Характеристика гормонрецепторного связывания

Для характеристики взаимодействия гормона с рецептором или антителом предложены различные методы математического анализа.

При взаимодействии гормона [Г] с его специфическим рецептором [Р] простая обратимая реакция между двумя молекулами в условиях равновесия может быть охарактеризована как где [ГР] — гормонрецепторный комплекс. Предполагается, что как гормон, так и рецептор гомогенны и имеют один специфически связывающий участок. Взаимодействие гормона и рецептора далее можно описать следующим образом где Ка—равновесная константа ассоциации (л/моль или М~1), ka — константа скорости ассоциации, k— константа скорости диссоциации, Kd — константа диссоциации (моль/л, или М).

Зависимость между общей концентрацией рецепторов и концентрацией занятых рецепторов может быть изображена следующим образом где [Ро] — общая концентрация рецепторов, [ГР]— концентрация связанных с гормоном рецепторов, а [Р] — концентрация свободных рецепторов. Зная молярную концентрацию рецептора, можно определить число связывающих участков на клетку или на массу белка, умножив количество молей рецептора на 6,02•1023 (число Авогадро, или число молекул в моле).

Константы ассоциации, полученные в разных радиорецепторных исследованиях, обычно колеблются между 10 – 11 и 10 – 9M – 1. Однако не все графики Скетчарда линейны. Их нелинейность отражает аллостерическое межрецепторное взаимодействие, приводящее к повышению (положительная кооперативность) или снижению (отрицательная кооперативность) связывания гормона после начального взаимодействия его с рецепторами. Данные, полученные в исследованиях по рецепторному связыванию гормона, можно преобразовывать дальше, и с помощью графика Хилла выяснить, действительно ли в системе происходят аллостерические взаимодействия.

Если наклон прямой на графике Хилла значительно отличается от единицы, то они существуют. При получении нелинейного графика Скетчарда следует учитывать не только аллостерические взаимодействия, но и другие факторы. К ним относятся артефакты, обусловливаемые проведением анализов в неравновесных условиях, неточной оценкой неспецифического связывания, ошибками в разделении свободного и связанного гормона и значительными различиями сродства к рецептору меченого и немеченого гормона.

«Эндокринология и метаболизм», Ф.Фелиг, Д.Бакстер

Читайте далее:



Эти методы представляют собой варианты описанных биологических исследований in vitro. Они обычно обладают большей чувствительностью, чем радиоиммунологические методы, но значительно более громоздки и дороги при расчете на одно определение. Результаты цитохимических биологических исследований количественно оценивают на гистологических срезах с помощью специального устройства — микроденситометра. Гистологические срезы готовят из специфических для данного гормона тканей или клетокмишеней,…

Помимо проверки чувствительности и специфичности антисыворотки, а также возможности проявления неспецифических эффектов белков плазмы или сыворотки, необходимо убедиться в надежности стандартного гормона, используемого для интерполяции количества гормона в биологической пробе. Сходство реакции на стандарт и клинический образец нужно оценивать путем построения кривых доза—реакция для каждого из них, используя различные дозы гормона или различные объемы пробы…

Радиоиммунологические методы в настоящее время, вероятно, наиболее широко применяются для количественного определения гормонов и многих других соединений в биологических жидкостях. Как показывает само название, радиоиммунологический метод представляет собой иммунологическое исследование, в котором используют меченые гормоны или связывающие их антитела. Более 20 лет назад Berson и Yalow предложили радиоиммунологический метод определения инсулина. Этот метод основывался на…

Принцип радиорецепторного метода по существу не отличается от радиоиммунологического, только гормон, вместо того чтобы связываться с антителами, связывается со специфическим гормональным рецептором плазматической мембраны или цитозоля. Специфические рецепторы большинства полипептидных гормонов располагаются на наружной поверхности плазматической мембраны клеток, тогда как рецепторы биологически активных стероидов, а также тироксина и трийодтиронина — в цитозоле и ядрах. Чувствительность…

Реакция антиген—антитело обратима, но скорость диссоциации комплекса антиген—антитело значительно меньше, чем скорость его ассоциации. Количество гормона, связанное с антителом, является результирующей скоростей ассоциации и диссоциации. Поскольку в каждую пробирку вносят постоянную концентрацию антител и меченого гормона, количество импульсов, связанных с антителами, должно зависеть от концентрации немеченого гормона, добавляемого в виде стандарта или неизвестной пробы. Чем…