Характеристика гормонрецепторного связывания
Для характеристики взаимодействия гормона с рецептором или антителом предложены различные методы математического анализа.
При взаимодействии гормона [Г] с его специфическим рецептором [Р] простая обратимая реакция между двумя молекулами в условиях равновесия может быть охарактеризована как где [ГР] — гормонрецепторный комплекс. Предполагается, что как гормон, так и рецептор гомогенны и имеют один специфически связывающий участок. Взаимодействие гормона и рецептора далее можно описать следующим образом где Ка—равновесная константа ассоциации (л/моль или М~1), ka — константа скорости ассоциации, k— константа скорости диссоциации, Kd — константа диссоциации (моль/л, или М).
Зависимость между общей концентрацией рецепторов и концентрацией занятых рецепторов может быть изображена следующим образом где [Ро] — общая концентрация рецепторов, [ГР]— концентрация связанных с гормоном рецепторов, а [Р] — концентрация свободных рецепторов. Зная молярную концентрацию рецептора, можно определить число связывающих участков на клетку или на массу белка, умножив количество молей рецептора на 6,02•1023 (число Авогадро, или число молекул в моле).
Константы ассоциации, полученные в разных радиорецепторных исследованиях, обычно колеблются между 10 – 11 и 10 – 9M – 1. Однако не все графики Скетчарда линейны. Их нелинейность отражает аллостерическое межрецепторное взаимодействие, приводящее к повышению (положительная кооперативность) или снижению (отрицательная кооперативность) связывания гормона после начального взаимодействия его с рецепторами. Данные, полученные в исследованиях по рецепторному связыванию гормона, можно преобразовывать дальше, и с помощью графика Хилла выяснить, действительно ли в системе происходят аллостерические взаимодействия.
Если наклон прямой на графике Хилла значительно отличается от единицы, то они существуют. При получении нелинейного графика Скетчарда следует учитывать не только аллостерические взаимодействия, но и другие факторы. К ним относятся артефакты, обусловливаемые проведением анализов в неравновесных условиях, неточной оценкой неспецифического связывания, ошибками в разделении свободного и связанного гормона и значительными различиями сродства к рецептору меченого и немеченого гормона.
«Эндокринология и метаболизм», Ф.Фелиг, Д.Бакстер
Для чувствительных радиоиммунологических определений необходимо следующее: высокоочищенный гормон, несущий радиоактивную метку с достаточно высокой удельной активностью, чтобы в каждую пробирку можно было вносить только «следовые» его количества; реактивы, используемые в реакции присоединения метки, не должны изменять иммунореактивности гормона в существенной степени; антитела с достаточно высокой чувствительностью (сродством) и специфичностью, чтобы определить низкие физиологические уровни нужного…
В отдельных случаях концентрация рецепторов стероидных половых гормонов может определять успех определенных видов терапии. Так, вмешательства в деятельность эндокринной системы оказывают благоприятный эффект у женщин, больных раком молочной железы в пременопаузе, у которых раковая ткань содержит рецепторы эстрогенов. Такие вмешательства приносят успех у 50 — 70% женщин, у которых выявляется значительная концентрация рецепторов эстрогенов в…
В отношении взаимодействия антигена с антителами принимаются некоторые допущения: присутствующий гормон гомогенен и взаимодействует с антителами с равным сродством независимо от того, содержит он радиоактивную метку или нет; присутствующие антитела гомогенны и одна молекула антитела взаимодействует с одной молекулой гормона; два разных вида молекул — гормон и антитела — реагируют до тех пор, пока между…
После высвобождения из железы некоторые гормоны быстро распадаются и циркулируют в крови в виде фрагментов. Лучше всего это видно, вероятно, на примере ПТГ, который вскоре после выделения в кровь распадается на аминоконцевой и карбоксильноконцевой фрагменты. Последний фрагмент имеет гораздо более длительный период полужизни в крови, чем аминоконцевой. Однако биологической гормональной активностью обладает именно аминоконцевой фрагмент….
Наиболее широко применяемым методом йодирования белков является, вероятно, модифицированный метод, предложенный Greenwood, Hunter и Glover. В нем используется окисляющий агент хлорамин Т, превращающий Na125I в свободный йод, который затем включается главным образом в остатки тирозина. При использовании этого метода могут йодироваться и остатки гистидина. Для сохранения максимальной иммунореактивности необходимо, чтобы на молекулу гормона приходился только…
