Эффект сывороточных белков
Поскольку между различными стероидами, между тироксином и трийодтиронином и некоторыми их метаболитами и между различными формами витамина D отмечается выраженная структурная гомология, не всегда возможно получить антисыворотку, достаточно специфическую, чтобы без предварительного применения методов экстракции и разделения избирательно определять эти гормоны и их метаболиты. Некоторые гормоны циркулируют в крови, будучи связанными со специфическими белкамипереносчиками или более рыхлой связью с альбумином.
Для того чтобы избежать загрязнения радиоиммунологической системы связывающими белками сыворотки, необходимо вначале экстрагировать гормон соответствующим растворителем. Начальную экстракцию следует проводить и при малой специфичности антител к гормону. В некоторых случаях может оказаться достаточной дифференциальная экстракция, но в других необходимо произвести хроматографическое разделение гормонов. К наиболее распространенным средствам разделения структурно близких стероидов относятся тонкослойная хроматография и хроматография на колонках сефадекса LH20.
Поскольку крупные полипептидные гормоны циркулируют в крови, не будучи связанными с белками-переносчиками, начальный этап экстракции в этом случае не нужен, и аликвоту сыворотки можно прямо помещать в пробирку для анализа. Однако содержащиеся в сыворотке протеазы могут обусловить занижение концентрации некоторых полипептидных гормонов. Если разрушение гормона существенно изменяет его структуру, он может и не реагировать с антителами. В результате появляется необходимость добавления в пробу ингибиторов ферментов, чтобы противодействовать эффекту протеаз. К ингибиторам протеаз, добавляемых в сосуды с пробами на АКТГ, глюкагон и другие гормоны, которые могут подвергаться быстрой протеолитической деградации, относятся трасилол и бензамидин.
В отношении некоторых полипептидных гормонов отмечаются неспецифические эффекты сывороточных белков. Эти неспецифические белковые эффекты можно нивелировать, добавляя пустую сыворотку в пробирки для исследования, не содержащие сыворотки, с тем, чтобы все пробирки содержали сравнимые концентрации мешающих определению сывороточных белков. Каждую анти-сыворотку можно эмпирически проверять на неспецифический эффект белка в отношении реакции антиген—антитело.
«Эндокринология и метаболизм», Ф.Фелиг, Д.Бакстер
Гипофизэктомированных животных используют для того, чтобы исключить синтез и секрецию тестостерона в ответ на эндогенный Л Г. Этот метод является одним из классических и все еще применяется для характеристики препаратов ЛГ и ХГЧ. Он был впервые предложен более 40 лет назад Greep и соавт., а впоследствии модифицированы. Поскольку наклоны кривой дозареакция от одного биологического определения…
Существуют различные способы разделения связанного с антителами и свободного гормона. В системах для полипептидных гормонов обычно применяют «методику вторых антител». Поскольку исходный комплекс гормона с антителом растворим, с помощью простого центрифугирования разделить связанный и свободный гормон невозможно. В связи с этим после достижения равновесия между гормоном и первыми антителами добавляют вторые антитела, полученные на глобулин…
Большинство методов in vivo требует относительно больших объемов плазмы, мочи или тканевых экстрактов, содержащих достаточное количество гормона, чтобы вызвать значимый биологический эффект. В связи с этим подобные исследования, хотя они очень важны для исходной характеристики различных гормональных препаратов, оказываются непригодными для рутинного клинического применения. За последние несколько лет разработаны различные методы биологического исследования in vitro….
Если в сыворотке больного присутствуют эндогенные антитела, то при определении, проводимом с помощью метода двойных антител, могут быть получены завышенные результаты. Теоретически меченый гормон, добавленный в пробирку для анализа, свяжется либо с антителами больного, содержащимися в пробе сыворотки, либо с антителами, вносимыми в пробирку. Будучи получены на глобулин животного, у которого вырабатывали первые антитела, вторые…
При биологических исследованиях in vitro могут использоваться различные показатели; к ним относятся изменения концентрации стероидов, ферментов или циклических нуклеотидов. Вообще говоря, определения in vitro более чувствительны, чем соответствующие им определения in vivo, и требуют значительно меньших объемов экстрактов сыворотки, ткани или мочи. Однако при интерпретации результатов биологического исследования in vitro необходима особая осторожность, поскольку в…
