Разделение связанного и свободного гормона
Существуют различные способы разделения связанного с антителами и свободного гормона. В системах для полипептидных гормонов обычно применяют «методику вторых антител». Поскольку исходный комплекс гормона с антителом растворим, с помощью простого центрифугирования разделить связанный и свободный гормон невозможно. В связи с этим после достижения равновесия между гормоном и первыми антителами добавляют вторые антитела, полученные на глобулин животного того вида, у которого получали первые антитела.
Поскольку вторые антитела будут теперь связывать образовавшийся комплекс между гормоном и первыми антителами, то возникнет вторичный нерастворимый молекулярный комплекс, и связанный свободный гормон можно будет отделить простым центрифугированием. Например, если антитела к гастрину вырабатывались у кролика, то вторые антитела к кроличьему глобулину следовало бы получать у животного другого вида (лошади, овцы или козы).
Лошадиный антикроличий глобулин нужно было бы добавить в пробирку для анализа после установления равновесия в реакционной смеси, содержащей меченный 125I гастрин и кроличью антигастриновую сыворотку. Время, необходимое для установления равновесия реакции со вторыми антителами, зависит от концентрации кроличьей сывороткиносителя в реакционной смеси. Например, если первые антитела к гастрину получены от кролика, в пробирку для анализа можно дополнительно добавить кроличью сывороткуноситель или глобулин. Если кроличья сыворотканоситель занимает 2% объема пробирки, то для осаждения кроличьего глобулина следует добавлять относительно большой объем вторых антител (0,05 — 0,2 мл).
Поскольку равновесие достигается за время, определяемое первым законом действующих масс, то оно должно достигаться относительно быстро (за несколько часов). Это время вначале находят эмпирически и подбирают необходимый наименьший оптимальный объем вторых антител для каждой их партии, получаемой в лаборатории или от торговых фирм. В пробирки для анализа можно добавлять меньшие концентрации сыворотки носителя, что уменьшит необходимый объем вторых антител, но увеличит время, требуемое для достижения равновесия реакции с их участием.
«Эндокринология и метаболизм», Ф.Фелиг, Д.Бакстер
Большинство методов in vivo требует относительно больших объемов плазмы, мочи или тканевых экстрактов, содержащих достаточное количество гормона, чтобы вызвать значимый биологический эффект. В связи с этим подобные исследования, хотя они очень важны для исходной характеристики различных гормональных препаратов, оказываются непригодными для рутинного клинического применения. За последние несколько лет разработаны различные методы биологического исследования in vitro….
Если в сыворотке больного присутствуют эндогенные антитела, то при определении, проводимом с помощью метода двойных антител, могут быть получены завышенные результаты. Теоретически меченый гормон, добавленный в пробирку для анализа, свяжется либо с антителами больного, содержащимися в пробе сыворотки, либо с антителами, вносимыми в пробирку. Будучи получены на глобулин животного, у которого вырабатывали первые антитела, вторые…
При биологических исследованиях in vitro могут использоваться различные показатели; к ним относятся изменения концентрации стероидов, ферментов или циклических нуклеотидов. Вообще говоря, определения in vitro более чувствительны, чем соответствующие им определения in vivo, и требуют значительно меньших объемов экстрактов сыворотки, ткани или мочи. Однако при интерпретации результатов биологического исследования in vitro необходима особая осторожность, поскольку в…
Стероидные гормоны обычно содержатся в сыворотке в связанном с различными белками виде. Поскольку сывороточные белки могут обладать сродством к гормону, сходным со сродством антител, используемых в радиоиммунологическом анализе, то чтобы последний дал надежные результаты, гормоны нужно сначала экстрагировать, т. е. отделить от сывороточных белков. До широкого распространения радиоиммунологических методов кортизол и другие сходные стероиды, которые…
После лишения молекулы ХГЧ сиаловой кислоты (десиалилация) in vitro гормон оказывает такой же, если не больший, биологический эффект, что и его нативная, полностью сиалилированная молекула. С другой стороны, in vivo он проявляет очень небольшую биологическую активность, отражающую степень десиалилации его молекулы. Это расхождение определяется значительно более коротким периодом полужизни десиалилированного ХГЧ в плазме по сравнению…
