Разделение связанного и свободного гормона
Существуют различные способы разделения связанного с антителами и свободного гормона. В системах для полипептидных гормонов обычно применяют «методику вторых антител». Поскольку исходный комплекс гормона с антителом растворим, с помощью простого центрифугирования разделить связанный и свободный гормон невозможно. В связи с этим после достижения равновесия между гормоном и первыми антителами добавляют вторые антитела, полученные на глобулин животного того вида, у которого получали первые антитела.
Поскольку вторые антитела будут теперь связывать образовавшийся комплекс между гормоном и первыми антителами, то возникнет вторичный нерастворимый молекулярный комплекс, и связанный свободный гормон можно будет отделить простым центрифугированием. Например, если антитела к гастрину вырабатывались у кролика, то вторые антитела к кроличьему глобулину следовало бы получать у животного другого вида (лошади, овцы или козы).
Лошадиный антикроличий глобулин нужно было бы добавить в пробирку для анализа после установления равновесия в реакционной смеси, содержащей меченный 125I гастрин и кроличью антигастриновую сыворотку. Время, необходимое для установления равновесия реакции со вторыми антителами, зависит от концентрации кроличьей сывороткиносителя в реакционной смеси. Например, если первые антитела к гастрину получены от кролика, в пробирку для анализа можно дополнительно добавить кроличью сывороткуноситель или глобулин. Если кроличья сыворотканоситель занимает 2% объема пробирки, то для осаждения кроличьего глобулина следует добавлять относительно большой объем вторых антител (0,05 — 0,2 мл).
Поскольку равновесие достигается за время, определяемое первым законом действующих масс, то оно должно достигаться относительно быстро (за несколько часов). Это время вначале находят эмпирически и подбирают необходимый наименьший оптимальный объем вторых антител для каждой их партии, получаемой в лаборатории или от торговых фирм. В пробирки для анализа можно добавлять меньшие концентрации сыворотки носителя, что уменьшит необходимый объем вторых антител, но увеличит время, требуемое для достижения равновесия реакции с их участием.
«Эндокринология и метаболизм», Ф.Фелиг, Д.Бакстер
Радиоиммунологические методы в настоящее время, вероятно, наиболее широко применяются для количественного определения гормонов и многих других соединений в биологических жидкостях. Как показывает само название, радиоиммунологический метод представляет собой иммунологическое исследование, в котором используют меченые гормоны или связывающие их антитела. Более 20 лет назад Berson и Yalow предложили радиоиммунологический метод определения инсулина. Этот метод основывался на…
Для характеристики взаимодействия гормона с рецептором или антителом предложены различные методы математического анализа. При взаимодействии гормона [Г] с его специфическим рецептором [Р] простая обратимая реакция между двумя молекулами в условиях равновесия может быть охарактеризована как где [ГР] — гормонрецепторный комплекс. Предполагается, что как гормон, так и рецептор гомогенны и имеют один специфически связывающий участок. Взаимодействие…
Реакция антиген—антитело обратима, но скорость диссоциации комплекса антиген—антитело значительно меньше, чем скорость его ассоциации. Количество гормона, связанное с антителом, является результирующей скоростей ассоциации и диссоциации. Поскольку в каждую пробирку вносят постоянную концентрацию антител и меченого гормона, количество импульсов, связанных с антителами, должно зависеть от концентрации немеченого гормона, добавляемого в виде стандарта или неизвестной пробы. Чем…
Описан ряд клинических состояний, при которых нарушается взаимодействие между гормоном и его специфическим рецептором. Такие нарушения объясняют изменением числа рецепторов или их сродства к гормону, а также спонтанным образованием антител к гормональным рецепторам. У больных с атаксией телеангиэктазией может отмечаться резкая инсулинорезистентность вследствие выраженного уменьшения сродства рецепторов к инсулину. У некоторых больных со злокачественной миастенией…
Для чувствительных радиоиммунологических определений необходимо следующее: высокоочищенный гормон, несущий радиоактивную метку с достаточно высокой удельной активностью, чтобы в каждую пробирку можно было вносить только «следовые» его количества; реактивы, используемые в реакции присоединения метки, не должны изменять иммунореактивности гормона в существенной степени; антитела с достаточно высокой чувствительностью (сродством) и специфичностью, чтобы определить низкие физиологические уровни нужного…
