11 июля 2012

Выделение фрагмента С

После обработки EcoRI ДНК А12 выделен фрагмент С (16% левой части вирусного генома). При использовании ДНК-полимеразы из Е. coli на матрице ДНК А12 и С-фрагмента in vitro синтезирован ДНК-продукт, с помощью которого был осуществлен анализ на присутствие в геноме опухолевых клеток человека и грызунов последовательностей ДНК А12, в том числе и трансформирующих.

В первую очередь исследовали злокачественные новообразования желудочно-кишечного тракта человека, так как этот вирус был обнаружен в кале людей. В 18 пробах нормальных тканей и 34 пробах из опухолей желудочно-кишечного тракта человека, включая злокачественные опухоли прямой кишки, толстого и тонкого кишечника, полости рта, обнаружено по 0,1 копии генома вируса А12 на клетку (Mackey et al., 1976).

Трансформирующие последовательности не выявлены в 5 пробах нормальных и 32 пробах опухолевых тканей желудочно-кишечного тракта человека (1 — 2% генома А12 на клетку).

Последовательностей А12 не обнаружено также в 12 пробах нормальных тканей легких и 22 пробах тканей опухолей легких. В то же время клетки первичной опухоли хомяка, индуцированной вирусом А12, содержали 6 — 18 копий вирусного генома и более 90% его последовательностей.

А12 EcoRI — С-трансформирующий фрагмент на 50 — 68% гибридизировался с ДНК вирусов А18 и А31, которые также входят в состав высокоонкогенной группы аденовирусов. Однако этот фрагмент не гибридизировался со всеми остальными типами аденовирусов человека.

Yano и соавт. (1977) установили, что более чем 77% нуклеотидных последовательностей вирусного генома находится в ДНК клонированной линии клеток хомяка 12НЕ — С19, трансформированных вирусом А12. Подсчитано, что 5 — 10 копий вирусного генома в каждом из 11 изученных фрагментов ДНК из трансформированных клеток приходятся на гаплоидный клеточный геном (фрагменты А, С, D, E, F, G, H, I, J, К и L).

Предполагают, что только часть нуклеотидных последовательностей фрагмента В может присутствовать в клеточной ДНК.

Вопрос о месте интеграции трансформирующего фрагмента в клеточную ДНК в настоящее время не решен. Работы, проводимые в этом направлении, не позволяют пока дать однозначный ответ на вопрос о существовании единственного локуса, в который встраивается вирусная ДНК.

О характере взаимодействия вирусов группы герпеса с геномом клетки имеются еще недостаточно полные сведения. Это прежде всего объясняется методическими трудностями, связанными, во-первых, с низким титром вируса, например, ВЭБ, во-вторых, очень большим размером геномной ДНК (с молекулярной массой около 100Х106).

Вместе с тем показано, что основная масса ДНК ВЭБ с коэффициентом седиментации 55S находится в клетках лимфомы в несвязанном с ядром виде в форме плазмид (внехромосомный генетический элемент) или же объединяется с хромосомной клеточной ДНК лабильными водородными связями.

Причем клоны клеток лимфомы Беркитта, непродуцирующие инфекционный ВЭБ, содержали от 8,6 до 50 эквивалентов генома ВЭБ. В клетках карциномы носоглотки определялось в среднем 19,2 копии генома ВЭБ. В перевиваемых клеточных линиях лимфомы, продуцирующих ВЭБ, число геномов резко возрастало, например, клетки линии HPIK содержали 700 копий генома ВЭБ.

Важно отметить, что в ядрах клеток исследованных культур присутствовал полный вирусный геном, так как в таких клетках можно было индуцировать активацию ВЭБ под воздействием аналогов тимидина или путем переноса клеток в среду, обедненную аргинином.

«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Метод искусственных гетерокарионов оказался весьма эффективен для многих тест-систем клеток, трансформированных как РНК-, так и ДНК-содержащими онковирусами. В некоторых случаях индикаторные культуры использовали даже для титрования освобожденного вируса по фокусам трансформации, которые он индуцировал (Svoboda et al., 1975). Во всех этих экс-периментах чем больше был процент гетерокарионов, тем выше оказалась эффективность метода. Однако в системах,…

В экспериментах, проведенных А. И. Агеенко и соавт. (1975), из перевивных сарком (с 50-й по 60-ю генерацию), индуцированных у хомяков аденовирусом 12-го типа, полный инфекционный вирус выделялся постоянно. Обнаружено, что при заражении центрифугатами разрушенных клеток перевивных сарком культуры почки эмбриона человека (ПЭЧ) в среднем через 5 дней отмечалось начало цитогенного действия вируса. Из первичноиндуцированных сарком…

Установлена прямая пропорциональность между дозой различных агентов (митомицин С, бромдезоксиуридин, УФ- и 60Со-γ-облучение) и урожаем вируса, освобожденного из трансформированных клеток (Kaplan et al., 1975). Урожай вируса увеличивается по сравнению с контролем в 1000 — 10 000 раз. В линиях — продуцентах инфекционного SV40 доля индуцированных клеток составляла 2 — 6% (по данным определения продукции V-антигена…

Клетки, трансформированные всеми исследованными в настоящее время онкогенными ДНК-содержащими вирусами, в основном являются непермиссивными для полного репродуктивного цикла трансформирующего их вируса, и поэтому естественно, что полный инфекционный вирус ими не продуцируется. Как известно, существуют два крайних ответа пермиссивных клеток природного хозяина при взаимодействии с геномом ДНК-содержащих онковирусов — лизис и трансформация. Трансформация осуществляется тогда, когда…

Итак, по характеру взаимоотношений онковируса с трансформированной клеткой можно выделить следующие типы опухолевых клеток. Вируспродуцирующие клетки. Как правило, это относится к РНК-содержащим вирусам. Вирогенные клетки, в которых удается активировать вирусный геном с помощью различных методических приемов (трансплантации их естественным хозяевам онковируса или при использовании «контактной индукции», т. е. прямого контакта опухолевой клетки с чувствительной «индикаторной»…