23 мая 2012

Исследование субъединиц 30 — 40S РНК и геномных 70S РНК онкорнавирусов

Субъединицы 30 — 40S РНК и геномные 70S РНК многих онкорнавирусов детально исследованы с помощью электронной микроскопии и градиентного центрифугирования.

Для этого препараты РНК, например из RSV, инкубируют при 38 °С с белком гена 32 бактериофага Т4. Этот белок связывается с однонитевыми молекулами и способствует расплетению двунитевых участков, в результате чего молекулы РНК приобретают вытянутую форму. В определенных условиях длина молекулы РНК пропорциональна молекулярной массе.

Хотя все препараты РНК, обработанные указанным белком отличаются разными размерами, можно выявить главную фракцию РНК, которая сохраняет исходные коэффициенты седиментации.

Молекулы 30 — 40S РНК в присутствии белка гена 32 в электронном микроскопе выглядят как линейные структуры с двумя свободными концами, в отсутствии же белка они обладают высоким уровнем вторичной структуры. 60 — 70S РНК, обработанные этим белком, представлены сетеобразной структурой с 4 — 8 свободными концами.

Максимальная суммарная длина этих нитей 6,8 нм (молекулярная масса 6,1Х106). На основании проведенного анализа можно сделать следующие выводы. Молекулярная масса 60 — 70S РНК составляет 6Х106, 30 — 40S РНК — 2,8 — ЗХ106. 60 — 70S РНК представляет собой сетеобразную структуру, состоящую из двух 30 — 40-молекул, удерживаемых вместе во многих различных точках; 30 — 40S РНК — линейный полинуклеотид.

Поскольку молекулярная масса 60 — 70S РНК в 2 раза больше молекулярной массы 30 — 40S РНК, превращение 60 — 70S РНК в 30 — 40S РНК-структуры при денатурации является результатом диссоциации молекул РНК на две субъединицы, а не следствием конформационных изменений. Иными словами, комплекс 60 — 70S РНК, как считают, состоит из двух субъединиц 30 — 40S РНК.

Определена молекулярная масса интактной 60 — 70S РНК MTV, которая составила 6,45Х106 (Dion et al., 1977). В препарате такой РНК выявлено такое же количество двунитевых участков, как и в аналогичных молекулах РНК других онкорнавирусов.

После тепловой денатурации в препарате не удалось обнаружить двунитевых РНК.

Нативная 60 — 70S РНК состоит из двух субъединиц 30 — 40S РНК с молекулярной массой 2,93 X106.

Вместе с тем результаты применения классических физических методов определения молекулярной массы вирусного генома позволяют предположить, что в состав вириона онкорнавирусов входит лишь одна субъединица с молекулярной массой в пределах 3,8+0,3 — 4,8+0,4Х106.

Противоречивость приведенных данных прежде всего свидетельствует о недостаточности наших знаний о структурной организации генома онкорнавирусов.

Однако следует отметить, что предполагаемая модель фрагментированного генома, состоящего из 2 — 4 субъединиц 30 — 40S РНК, подтверждается данными биологических экспериментов, согласно которым инфекционность РНК опухолеродных вирусов пропорциональна количеству 30 — 40S РНК, выделенной из вируса, а не количеству 60 — 70S РНК.

Силы, удерживающие сетевидную структуру 60 — 70S РНК, неизвестны. Предполагают, что это могут быть водородные связи, поскольку они устойчивы к SDS и проназе, но чувствительны к нагреванию и обработке диметилсульфоксидом.

«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Количественные определения в опытах с использованием импульсной метки, а также данные, полученные с ингибиторами белкового синтеза и канаванином, говорят о том, что протеолитическое расщепление Рrlа + b является первым путем образования промежуточных предшественников обратной транскриптазы — PrRTl, 2 и 3. Вместе с тем неясно, играет ли какую-то роль этот путь расщепления в образовании продуктов gag-гена….

Определен полный аминокислотный состав р30 вирусов С-типа мышей, кошек, крыс и обезьян, свидетельствующий о сходстве этих белков по этому критерию. Белок р30 богат остатками аминокислот с полярными боковыми цепями (лизин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты или их амиды), беден цистеином, метионином, гистидином и изолейцином. Исследование первых 30 остатков с NН2-конца р30 показало высокий уровень родства…

Основная масса вирусспецифических полипептидов синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах, а часть находится во фракции свободных полирибосом, где и происходит их синтез. Методом иммунопреципитации пептидов удалось определить размеры этих полирибосом — 350S. Эта величина свидетельствует о том, что вирусные мРНК транслируются на полирибосомах, состоящих из 12 монорибосом. На полирибосомах такого размера могут транслироваться мРНК с молекулярной массой…

Продолжая эти исследования, Pawson и соавт. (1977) установили, что в бесклеточной белоксинтезирующей системе (использовали либо асцитные, либо клетки L) белок, синтезируемый геномной 30 — 40S-PHK RSV, имел молекулярную массу 76 000 и осаждался антисывороткой к разрушенному вирусу и р12, р30, но не антисывороткой к gp85. Смотрите — Трансляция РНК онкорнавирусов in vivo Следовательно, Рr76 является…

В клетках, зараженных R — MuLV, идентифицировано несколько быстрометящихся нестабильных высокомолекулярных белков: Prla±b (с массой около 200 000) — предшественник р30, р15, р12, р 10 и обратной транскриптазы; Prla±b (с массой около 90 000) — предшественник gp69/71, p 15(Е) и р12(Е); Рr3 (с массой около 80 000) и Рг4 (с массой около 70 000) —…