Мониторинг инфекции и дизбиозов методом масс-спектрометрии микробных маркеров
Институт Аналитической Токсикологии
Резюме. Вариант молекулярного микробиологического анализа по методу масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ) позволяет единовременно из одной пробы количественно определять разнородные микроорганизмы (аэробы, анаэробы, актинобактерии, грибы, вирусы) по молекулярным маркерам их клеточной стенки непосредственно в клиническом материале (кровь, раневое отделяемое, ликвор и т. п.) в течение двух часов с момента его поступления в лабораторию. Этим методом найдено, что доминантами инфекции в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ), в том числе — при сепсисе, являются грамположительные анаэробы (клостридии, лактобациллы, эубактерии). Второй уровень по численности представляют актинобактерии родов Nocardia, Pseudonocardia, Rhodococcus и дрожжиCandida. Далее по ранжиру следуют стафилококки, стрептококки, энтерококки и грамотрицательные микроорганизмы: энтеробактерии, псевдомонады, бактероиды и фузобактерии. Экспрессность и точность анализа обеспечивает оперативный мониторинг процесса лечения. Наблюдение за развитием инфекции в динамике (31 пациент) показало, что микробные агенты сепсиса и септического шока различны для этих состояний, что их провоцирует одна группа бактерий, а ведет процесс – другая. Вопрос о выборе антибиотиков для большинства некультивируемых в клинической лаборатории микроорганизмов решается положительно путем использования литературных данных с выбором препаратов, приемлемых для конкретного больного. Результаты повторного анализа показывают реальный эффект назначенной терапии, в том числе чувствительность in-vivo к антибиотикам.
Ключевые слова: Инфекция, сепсис, газовая хроматография, масс-спектрометрия, жирные кислоты, микробные маркеры, анаэробная инфекция, клостридии, эубактерии, актинобактерии.
Key words: Infection, sepsis, gas chromatography, mass-spectrometry, fatty acids, microbial markers, anaerobes, clostridia, eubacteria, actinobacteria.
Цель. Изучить возможности мониторинга инфекции и дисбиоза в клинике методом МСММ, используя присущую ему экспрессность и широту спектра определяемых микробов непосредственно в клиническом материале, минуя стадию культивирования.
Материалы и методы. Методом масс-спектрометрии микробных маркеров [2, 5] по концентрации клеточных высших жирных кислот, альдегидов, а также метаболических стеринов в крови, экссудатах и пунктатах пациентов (N=400) отделений реанимации и интенсивной терапии НИИ СП им Н.В. Склифосовского реконструирован состав микробного сообщества в целом (микроэкологический статус) и в инфицированных органах в частности. В том числе 35 пациентов в динамике от 2 до 9 измерений в процессе лечения. Оценить степень дисбактериоза и инфекционную нагрузку пациента количественно в динамике и быстро по широкому кругу клинически значимых микроорганизмов можно только методом масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ) в крови, ликворе, мокроте, моче, пунктатах, экссудатах, дренаже, смыве и другом клиническом материале непосредственно, минуя стадию культивирования.
Это позволяет сделать высокая чувствительность метода газовой хроматографии – масс спектрометрии (ГХ-МС) и видовая специфичность используемых маркеров из числа жирных кислот и альдегидов клеточной стенки микроорганизмов, а также стериновых метаболитов грибов и вирусов. Суть анализа состоит в прямом извлечении с помощью экстракции высших жирных кислот, альдегидов и стеринов из подлежащего исследованию образца, их разделения на хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения и анализа состава на масс-спектрометре. Поскольку хроматограф соединен в едином приборе с масс-спектрометром и снабжен компьютером с соответствующими программа-ми автоматического анализа и обработки данных, сам процесс анализа занимает 30 мин, а с учетом времени пробоподготовки и расчета данных — не более двух часов. Его результатом является количественное определение состава микроорганизмов. Исследование проведено на ГХ-МС системе Микробиологический анализатор «Маэстро» компании ООО «Интерлаб» в которой штатная программа «Химстанция» включает алгоритмы технологии МСММ [4 ].
Результаты и обсуждение. Микроэкологический статус человека, точнее, поддержание его гомеостаза, является необходимым условием стабильного функционирования всех его органов и систем [7, 9, 11]. Соответственно, одним из первых мероприятий по обеспечению качества и продолжительности жизни, а тем более в лечении любых заболеваний, особенно клинических отделениях реабилитации и интенсивной терапии, должен быть контроль и восстановление микробиоценоза, если он оказался нарушенным [8]. А он оказывается нарушенным при тяжелых физических, химических и ожоговых травмах людей, которые требуют скорой помощи [6]. Микробиота кишечника продуцирует около 60% веществ, необходимых для функционирования клеток внутренних органов и кожи хозяина, а также дополняет его собственный физиологический потенциал серией энзиматических реакций. Поэтому меры по восстановлению микроэкологического статуса больного надо рассматривать в качестве активной терапии.
Нарушение микроэкологии носит двойственный характер: дисбиоз и инфекция. Дисбиоз в прямом смысле слова – изменение микроэкологического статуса пациента, то есть отклонение от гомеостатической нормы колонизации микроорганизмами кишечника и слизистых оболочек других органов и кожного эпителия. Избыточный рост части микроорганизмов, по определению, считается инфекцией. Она в основном эндогенна и полимикробна. Для целей диагностики инфекции по липидным маркерам важно, что компоненты микробных клеток со слизистых оболочек и инфицированных органов попадают в кровь и другие биологические жидкости и могут быть определены в ней методом ГХ-МС, а действующее микробное сообщество можно реконструировать по технологии МСММ.
По данным оценки микроэкологического статуса пациентов по микробным маркерам в крови (число обследованных N=400) начальным звеном, предшествующим сепсису является стресс, в результате которого, резко снижается до 10-кратного уровня по сравнению с нормой колонизация кишечной стенки микроорганизмами. При раневой инфекции и сепсисе в крови больных и материалах из внутренних органов и кожи обнаружен избыточный рост маркеров микроорганизмов родов Clostridium, Lactobacillus, Eubacterium, актинобак-терий Streptomyces и Nocardia, видов сем. Enterobacteriaceae (E. coli, Proteus, Klebsiella и другие), Staphylococcus, Enterococcus, Pseudomonas, Moraxella, Fu-sobacterium, Haemophylus, Selenomonas, Helicobacter, Prevotella, Acinetobacter, Bacteroides, Candida и других бактерий, а также микроскопических грибов и вирусов. Метод МСММ незаменим при мониторинге инфекции в клинике, поскольку его практическая периодичность сканирования маркеров широкого круга микроорганизмов составляет 2 часа. Поэтому, мы видим, что нарастание численности большинства из перечисленных микроорганизмов происходит в течение трех-пяти суток пребывание пациента в стационаре, что подпадает под определение внутрибольничной инфекции и расширяет круг значимых в этой категории микроорганизмов. Наблюдение за развитием инфекции в динамике (31 пациент) показывают, что микробные агенты сепсиса и септического шока различны для этих состояний, что их провоцирует одна группа бактерий, а ведет процесс – другая. Например, за две недели до шока (это ранняя диагностика!) наблюдается рост концентрации маркеров Clostridium perfringens, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes и стафилококков. В дни септического шока и последующего септического состояния основными патогенами являются клостридии группы Clostridium ramosum, оральные стрептококки, анаэробныйпептостреп-тококк и нокардии. Второй уровень составляют C. perfringens, Bacillusc ereus и группа Moraxella/Acinetobacter, а также стафилококки и псевдомонады. В постшоковый период происходит увеличение концентрации маркеров Blautia coccoides, B. cereus и вирусов, а также дрожжей кандида и микроскопических грибов. По мере выхода из шока растут маркеры основной микробиоты кишечника — бифидобактерий, лактобацилл, зубактерий и пропионобактерий. В инфицированных органах идет интенсивный воспалительный процесс, при котором концентрация микробных маркеров на порядки превышает их уровень в крови.
Анализ фракции карбоновых кислот (тоже ГХ-МС методом) из плазмы крови в те же дни показал в предшоковый период рост концентрации молочной кислоты (продуценты лактобациллы, бифидобактерии, клостридии, эубактерии), щавелевой, 2-гидроки-изовалериановой (клостридии), фенилмолочной (C. perfringens, Eubacterium lentum) что согласуется с пиком концентрации клеточных маркеров клостридий группы C. perfringens и E.lentum а также началом подъема концентрации маркеров группы C. ramosum при многократном дефицителактобацилл и бифидобактерий в общем микроэкологическом статусе пациента.
В период септического шока достигает максимума концентрация молочной кислоты – к ее продукции подключается пептострептококк. Максимальное значение принимают также маркеры щавелевой, 2-гидроки-изовалериановой, фенилмолочной кислот. В этот период максимальны 2-гидрокси-изомасляная (клостридии), парагидроксифенилмолочная, 2-гидрокси-гексановая, яблочная, 3-гидрокси-масляная, декановая, капроновая, кето-изокапроновая, каприловая, бензойная, гидрокси-уксусная и пара-гидроксифенил-уксусная (Bacteroides fragilis) кислоты. Увеличение концентрации маркеров B. coccoides, B. Cereus и вируса герпеса в постшоковый период можно рассматривать как оппортунистическую инфекцию. Обычные оппортунисты – кандида и микроскопические грибы, определяемые по появлению в крови их стероидных метаболитов – ситостерола и кампестерола, тоже проявляют рост. Однако он происходит в пределах нормальных значений концентраций маркеров в крови, поэтому можно считать это восстановлением нормальной микробиоты организма.
Мониторинг инфекции и дисбиоза пациента ОРИТ. Ниже приведен конкретный пример мониторинга инфекции и дисбиоза (микробиом, по современным понятиям), а также кислот метаболических циклов человека и микроорганизмов (метаболом). Выполнено девять анализов микроэкологического статуса пациента: два до септического шока, один во время шока и шесть после. Результаты приведены на рисунках. Данные по сумме МО показывают, что больной поступил с серьезным (четырехкратным) дефицитом нормальной микробиоты. Анализ пробы от 26.01.2011 соответствует третьему дню пребывания больного в клинике. Избыточная концентрация маркеров МО в крови, следовательно избыточный рост самих микробов, продуцирующих эти маркеры, то есть инфекция (по определению А.А. Воробьева), происходит в дни септического шока и последующего септического состояния. По данным изменений основными патогенами в количественном отношении (от 5х107 до 3х108) следует считать клостридии группы Clostridium ramosum, оральные стрептококки, анаэробный пептострептококк и нокардии. Второй уровень, менее 2х107 составляют Clostridium perfringens, группы Bacillus cereus и Moraxella/Acinetobacter, а также стафилококки и псевдомонады. Эти изменения можно наглядно видеть на графиках рис 1 и 2 соответственно.
Мониторинг состояния микробиоты до септического шока (18.02.2011) позволяет выявить провоцирующие его микроорганизмы. За две недели до шока (это ранняя диагностика!) наблюдается рост концентрации маркеров Clostridium perfringens, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes и стафилококков, хотя последние остаются ниже обычно наблюдаемого уровня у здоровых людей, но обнаруживают тенденцию к росту.
Анализ фракции карбоновых кислот (тоже ГХ-МС методом) из плазмы крови в те же дни показал в предшоковый период рост концентрации молочной кислоты (продуценты лактобациллы, бифидобактерии, клостридии, эубактерии), щавелевой, 2-гидроки-изовалериановой (клостридии, [10]), фенилмолочной (C. perfringens, Eubacterium lentum, [1]) что согласуется с пиком концентрации клеточных маркеров клостридий группы C. Perfringens и E.lentum а также началом подъема концентрации маркеров группы C. ramosum при многократном дефиците лактобацилл и бифидобактерий в общем микроэкологическом статусе пациента.
В период септического шока достигает максимума концентрация молочной кислоты – к ее продукции подключается пептострептококк. В максимуме также маркеры щавелевой, 2-гидроки-изовалериановой, фенилмолочной кислот. В этот период максимальны 2-гидрокси-изомасляная (клостридии), пара-гидроксифенил-молочная, 2-гидрокси-гексановая, яблочная, 3-гидрокси-масляная, декановая, капроновая, кето-изокапроновая, каприловая, бензойная, гидрокси-уксусная и пара-гидроксифенил-уксусная (Bacteroides fragilis) кислоты.
Увеличение концентрации маркеров Blautia coccoides, Bacillus cereus и вируса герпеса в постшоковый период можно рассматривать как оппортунистическую инфекцию. Обычные оппортунисты – кандида и микроскопические грибы, определяемые по появлению в крови их стероидных метаболитов – ситостерола и кампестерола, тоже проявляют рост. Однако он происходит в пределах нормальных значений концентраций маркеров в крови, поэтому можно считать это восстановлением нормальной микробиоты организма. По мере выхода из шока стали расти и маркеры МО основной микробиоты кишечника – бифидобактерий, лактобацилл, зубактерий и пропионобактерий. Начальный уровень бифидобактерий по анализу от 26.01.2011 был в 25 раз ниже нормы, в период шока их маркеры вообще перестали обнаруживаться (т.е. численность ниже 105 клеток/мл) или в 5000 раз ниже нормы. После лечебных мероприятий к 06.04.2011 уже можно констатировать выход микроэкологического статуса на нормальное состояние, за исключением дефицита лактобацилл.
Амбулаторный мониторинг тяжелого дематита. Пациентка дли-тельное время страдает гнойничковым дерматитом не установленной этиологии. Предполагался псориаз, в Германии проведено лечение препаратом муравьиной кислоты, который не дал ожидаемого эффекта.
Впоследствии этот диагноз был снят. После неоднократного обращения к специалистам различного профиля в России и за рубежом пациентка обратилась с просьбой провести обследование методом МСММ общего микроэкологического статуса организма по крови и локальной инфекции в респираторных органах (мокрота) и мочевыводящих путях (моча), а также в соскобе пораженного участка кожи. Предполагалось, что в них (так же как в кишечнике) может быть депо микроорганизмов, ответственных за дерматит. Анализ крови на микробные маркеры показал, что уровень клинической значимости (выше нормы более чем в два раза) имеют маркеры вирусов герпеса и цитомегаловируса, бактерий Eubacterium lentum, Nocardia, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Propionibacterium acnes и Propionibacterium jensenii при дефиците лакто-бацилл. Микроэкологический статус в целом оказался близок к норме, за исключение дефицита лактобацилл. Основным инфекционным агентом является цитомегаловирус. В моче клинически значимый уровень превышает 2-гидрокситетракозановая кислота — маркер грибов группы Aspergillus. В мокроте обнаружена множественная инфекция разнородными микроорганизмами. Наибольшую клиническую значимость имеют и доминируют анаэробные пептострептококки, Streptococcus mutans (тоже анаэробные), стрептококки оральные, клостридии группы Clostridium ramosum и Clostridium 12:0 group, в которую входят Clostridium perfringens, С. putrefacience, C. hystolyticum, C. tetani, микроскопические грибы (возможно Aspergillus-тип), кишечные лактобациллы, эубактерии и пропионобактерии. Выше нормы численность Bacteroides fragilis, C.perfringens, стафилококков, коринебактерий, актинобактерий Actinomyces viscosus, цитомегаловируса, грамотрицательных бактерии Moraxella, Haemophylus и других. В коросте (засохшая головка гнойника) доминируют анаэробные пептострептококки, клостридии группы Clostridium ramosum, микроскопические грибы Aspergillus и коринебактерии. Выше нормы численность стафилококков, стрептококков Streptococcus mutans (анаэробные), актинобактерий Actinomyces viscosus, цитомегаловируса, грамотрицательных бактерий Alcaligenes и других.
Сопоставление проведенных выше данных анализа позволяют предположить, что депо кожной инфекции (анаэробные пептострептококки, клостридии группы C. ramosum, микроскопические грибы и другие) находится в респираторном тракте (таблица). После ряда лечебных мероприятий и антигрибковой терапии орунгалом, в том числе, профиль микробных маркеров в крови изменился незначительно, но тенденция отрицательная. Выросла численность цитомегаловируса и актинобактерий при уменьшении количества «полезных» бактерий. Появился Peptostreptococcus аnaerobius. В моче по сравнению с предыдущим анализом обнаружены маркеры актинобактерий, клостридий группы Clostridium tetani и Campylobacter mucosalis. Концентрация маркера грибов увеличилась вдвое. P. anaerobius, C. ramosum и цитомегаловирус в повтор-ном анализе не обнаружены. В мокроте разница в результатах заметная.
Ушли грибы – орунгал подействовал, а также P. anaerobius, C. tetani, C. perfringens, Bacteroides fragilis, Prevotella, Moraxella, P. aeruginosa, виды Haemophylus, Alcaligenes, существенно уменьшена численность Streptococcus mutans, коринебактерий и Clostridium propionicum, но появились E.coli, Campylobacter mucosalis, Nocardia asteroides. Цитомегаловирус существенно вырос, а также P. freudenreichii, энтерококки, кандида и E. lentum. Они остались в качестве подозреваемых в связи с дерматитом вместе с C. ramosum, A. viscosus, лактобациллами и эубактериями E. moniliforme, E.nodatum, E.sabureum, которые сохраняют свою прежнюю избыточную численность.
После следующего этапа лечения (метронидазол + вобензим) ушли кишечные, уменьшилась численность лактобацилл, энтерококков и вирусов, но появились грибы и клостридии. Можно полагать, что метронидазол подействовал на кишечные микробы, а вобензим освободил из биопленки клостридии, их токсины спровоцировали обострение. На следующем этапе лечения (бисептол + вобензим), как ожидалось, бисептол подействовал на клостридии, а также на Actinomyces viscosus. Удалены вирус Эпштейна-Барр и нокардии, но активизировались C. Perfringens и появились кишечные бактерии и грибы. Анализ маркеров в крови в тот же день обнаружил положительную тенденцию изменения микроэкологического статуса. Снизилась концентрация маркеров цитомегаловируса. Компенсирован избыточный рост бактериальной составляющей.
Удален P. anaerobius. Выросли бифидобактерии, но сократилась численность лактобацилл. Основной проблемой общего микроэкологического статуса остается вирусная инфекция и дефицит лактобацилл. Это показатели сниженного иммунитета. Кожные проявления заболевания к этому моменту были сведены к минимуму, поэтому для предотвращения рецидивов, пациентке было рекомендовано обратится за консультацией к иммунологу.
Суточный мониторинг лихорадки неясного генеза. Родственники пациентки отделения гематологии, проходившей курс лечения по поводу заболевания крови, обратились с просьбой выполнить анализ МСММ на предмет выявления инфекции, ответственной за лихорадку неясного генеза. Лихорадка имела суточный цикл: к вечеру поднималась температура, которая в пике в полночь доходила до 40 градусов, а к утру спадала. Забор крови и анализ на микробные маркеры провели в 6, 12, 18 и 24 часа. Анализ показал доминирующий уровень Clostridium ramosum в течение дня от шести утра до шести вечера. Логично предположить, что это основной патоген и токсиген. К ночи его уровень падает втрое. В этот же период многократно превышает норму численность дрожжей Candida и актинобактерий Nocardia. В 18 час происходит резкое увеличение концентрации маркеров цитомегаловируса, стрептококков гр А и анаэробов Prevotella. К полуночи достигает макимума численность H. pylori, C. perfringens и Streptococcus mutans.
Следовательно, ЦМВ, Prevotella и стрептококки гр А являются провокаторами приступа. Его основными возбудителями оказываются H. pylori, C. perfringens и S. mutans, а поддерживают постояннную инфекцию C. ramosum, Nocardia и Candida, которые представляют терапевтическую инфекцию. При этом стабильно низок, как при сепсисе, уровень плазмалогена.
Выводы. Из приведенных данных следует, что метод масс-спектрометрии микробных маркеров эффективен в мониторинге различных клинических и амбулаторных лечебных мероприятий с целью выявления микробной этиологии заболевания, назначения адекватной антибиотикотерапии и восстановления микроэкологического статуса пациентов до нормального уровня.
Преимущество метода МСММ по сравнению с культурально-биохимическим, генетическим и другими методами микробиологического анализа состоит в возможности в едином цикле анализа за 2 часа количественно определять состав микробного сообщества в клиническом материале без предварительного культивирования, одновременно широкий круг микроорганизмов, включая анаэробы, актинобактерии, грибы и вирусы..
Он лишен зависимости от праймеров и фирменных дорогостоящих наборов, культуральных сред и биохимических реактивов.
Метод имеет коммерческую реализацию в микробиологическом анализаторе «Маэстро», предлагаемом компанией ООО «Интерлаб».
Литература: 1. Белобородова Н.В., Байрамов И.Т., Оленин А.Ю., Федотчева Н.И. Экзометаболиты некоторых анаэробных микроорганизмов микрофлоры человека.
Биомедицинская химия. 2011, 57, вып 1, с 95-105.
- Годков М.А., Осипов Г.А., Федосова Н.Ф., Лядов К.В. Возможности масс-спектрометрии микробных маркеров в лабораторном мониторинге дисбиозов и инфекций. Справочник заведующего КДЛ. 2011, № 7, С. 35-44
- Дисбиоз кишечника. Е.И. Ткаченко, А.Н. Суворов, ред. СПб. :Информ-Мед, 2009. – 276с., ил.
- Микробиологический анализатор «Маэстро» компании ООО «Интерлаб» http://www.interlab.ru/mba 5. Осипов Г.А. Хромато-масс-спектрометрический анализ микроорганизмов и их сообществ в клинических пробах при инфекциях и дисбиозах. / В книге: Химический анализ в медицинской диагностике.- М.: Наука, 2010.- С.293-368.
- Смирнов С.В., Борисов В.С., Васина Т.А., Осипов Г.А. Диагностика бактериемии у больного с тяжелой ожоговой травмой методом масс-спектрометрии микробных маркеров. Земский врач, № 6 / 2012, 15-17
- Ткаченко Е.И., Успенский Ю.П. Питание, микробиоценоз и интеллект человека. СПб.: СпецЛит. 2006. – 590 с.: ил.
- Федосова Н.Ф., Лядов К.В., Осипов Г.А Новые подходы к анализу инфекционных послеоперационных и посттравматических осложнений, Инфекции в хирургии, Том 8, 2010 г., №2- С.56-62
- Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: 3 т. – М.: Грант, 1998. – Т. 1: Микрофлора человека и животных и ее функции. – С. 14–17.
- Сarlier J.-P., Sellier N. Gas chromatographic — mass spectral studies after methylation of methabolites, produced by some anaerobic bacteria in spent media.
J.Chromatogr. Biomed.Appl. -1989.-Vol.493.-P.257-273.
- Nicholson JK and Holmes E. Global systems biology and personalized healthcare solutions. Discov Med, Apr 2006; 6(32): 63-70.
© Осипов Г.А.
Рассмотрим возможности приобретения жилой площади в течение трех календарных лет с применением специальных средств, предназначенных для поддержки семей с маленькими детьми. Имущество, недвижимость, жилье — все это основные атрибуты комфортного проживания, которые можно приобрести с использованием финансовых возможностей, предоставляемых государством для семей, имеющих детей до определенного возраста. Получение материнского капитала на приобретение жилплощади Какие документы…
Костная пластика челюсти — это хирургическая процедура, направленная на восстановление или улучшение структуры костной ткани челюсти. Это важный этап при подготовке к имплантации зубов и других стоматологических вмешательствах. В этой статье мы рассмотрим, какие показания существуют для проведения костной пластики, как она проводится и какие результаты можно ожидать после операции. Показания и причины для проведения…
В наше время поиск нужного лекарства может стать настоящей проблемой. Различные аптеки предлагают разные цены, а нужный препарат может быть не в наличии. Чтобы упростить этот процесс, создан сайт-агрегатор 009.рф. Он не является интернет-аптекой, но позволяет узнать, в какой аптеке и по какой цене можно приобрести нужное лекарство. Такой сервис особенно полезен для сравнения цен…
Финансовые рынки всегда были связаны с изменчивостью. Однако в последние годы волатильность стала неотъемлемой частью трейдинга. Это создает как риски, так и возможности для трейдеров. В этой статье мы рассмотрим, как успешно заниматься трейдингом в условиях волатильности и какие стратегии и советы помогут вам управлять рисками и добиваться успеха. Стратегии для трейдинга в условиях волатильности…
Мир ставок на спорт не перестает удивлять своей разнообразием и успешными историями. В этой статье мы представим вам трех лучших капперов, чьи прогнозы завоевали сердца и кошельки ставочников по всему миру. Айнур Казанцев Айнур Казанцев, основатель канала «Семейный Прогноз» на YouTube, представляет собой интересное явление в мире ставок. С его 14 тысячами подписчиков он регулярно…