5 июля 2012

Генетические карты ДНК-содержащих онковирусов

Паповавирусы

За последние годы разработаны следующие методики исследования молекулярно-генетической структуры генома SV40:

  1. анализ функций фрагментов ДНК SV40 различной длины, интегрированных в определенные участки некоторых аденовирусных генов (недефектные гибриды Ad2+XSV40); эта система рассматривается как модель взаимодействия SV40 с ДНК клетки-хозяина,
  2. специфические разрывы молекул ДНК SV40 с помощью ограничивающих бактериальных эндонуклеаз (рестриктаз).

Кроме того, наличие асимметрического неодновременного синтеза РНК на матрице интегрированной в клеточный геном ДНК паповавирусов позволяет также картировать геномы этих вирусов, так как в настоящее время известно, какие белки являются продуктами ранних и поздних генов.

Каждый недефектный гибрид (ND) SV40 — Ad2+ND1-5 содержит один сегмент (различной длины) ДНК SV40, ковалентно встроенный в специфический локус генома Ad2.

Гибридные вирусы обязательно содержат концевые районы раннего гена SV40, продукт которого необходим для размножения аденовирусов в обезьяньих клетках (Sambrook, 1977). Экспрессия раннего гена поставлена под контроль аденовируса, при этом синтезируется гибридная РНК, на которой синтезируются гибридные белки.

Транскрипция гибридных молекул осуществляется подобно транскрипции фрагмента или всего вирусного генома, интегрированного в ДНК клетки. РНК-полимераза аденовируса синтезирует часть мРНК, а затем непрерывно присоединяет к ней перекрывающиеся последовательности РНК, закодированные на встроенном сегменте ДНК SV40, пропорционально его величине.

Направление копирования гена SV40 в гибриде то же самое, что и в геноме исходного вируса SV40. Следовательно, недефектные гибриды Ad2+ND1-5 могут синтезировать как ранние белки, специфичные для вируса SV40, т. е. Т- и TSTA-антигены, так и термостабильные новые U-антигены.

Для анализа генома SV40 применили несколько ограничивающих эндонуклеаз из различных бактерий, которые разделяются на два класса: не обладающие специфичностью разрыва (например, рестриктаза из штамма Е. coli В) и обладающие специфичностью (рестриктазы из Е. coli RI и RII, H. influenzae, H. parainfluenzae).

Все рестриктазы переводят замкнутую циркулярную ДНК SV40 в линейную форму, при этом рестриктаза из Н. inlfuenzae вызывает образование И фрагментов, а из Н. parainfluenzae 4 фрагментов.

Для составления карты генома с помощью этих фрагментов использовали следующие подходы: полное переваривание отдельных фрагментов с последующим анализом перекрывающихся участков и последовательное переваривание рестриктазами из Н. influenzae и Н. parainfluenzae.

За точку отсчета (нулевую точку) принят одиночный разрыв в специфичном участке ДНК SV40, продуцируемый рестриктазой Е. coli RI. Для определения точек инициации и терминации репликации использовали импульсную метку по 3Н-тимидину с.последующим определением последовательности синтеза различных сегментов молекулы.


«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Метод искусственных гетерокарионов оказался весьма эффективен для многих тест-систем клеток, трансформированных как РНК-, так и ДНК-содержащими онковирусами. В некоторых случаях индикаторные культуры использовали даже для титрования освобожденного вируса по фокусам трансформации, которые он индуцировал (Svoboda et al., 1975). Во всех этих экс-периментах чем больше был процент гетерокарионов, тем выше оказалась эффективность метода. Однако в системах,…

В экспериментах, проведенных А. И. Агеенко и соавт. (1975), из перевивных сарком (с 50-й по 60-ю генерацию), индуцированных у хомяков аденовирусом 12-го типа, полный инфекционный вирус выделялся постоянно. Обнаружено, что при заражении центрифугатами разрушенных клеток перевивных сарком культуры почки эмбриона человека (ПЭЧ) в среднем через 5 дней отмечалось начало цитогенного действия вируса. Из первичноиндуцированных сарком…

Установлена прямая пропорциональность между дозой различных агентов (митомицин С, бромдезоксиуридин, УФ- и 60Со-γ-облучение) и урожаем вируса, освобожденного из трансформированных клеток (Kaplan et al., 1975). Урожай вируса увеличивается по сравнению с контролем в 1000 — 10 000 раз. В линиях — продуцентах инфекционного SV40 доля индуцированных клеток составляла 2 — 6% (по данным определения продукции V-антигена…

Клетки, трансформированные всеми исследованными в настоящее время онкогенными ДНК-содержащими вирусами, в основном являются непермиссивными для полного репродуктивного цикла трансформирующего их вируса, и поэтому естественно, что полный инфекционный вирус ими не продуцируется. Как известно, существуют два крайних ответа пермиссивных клеток природного хозяина при взаимодействии с геномом ДНК-содержащих онковирусов — лизис и трансформация. Трансформация осуществляется тогда, когда…

Итак, по характеру взаимоотношений онковируса с трансформированной клеткой можно выделить следующие типы опухолевых клеток. Вируспродуцирующие клетки. Как правило, это относится к РНК-содержащим вирусам. Вирогенные клетки, в которых удается активировать вирусный геном с помощью различных методических приемов (трансплантации их естественным хозяевам онковируса или при использовании «контактной индукции», т. е. прямого контакта опухолевой клетки с чувствительной «индикаторной»…