31 мая 2012

Картирование генома

Как отмечалось выше, каждая субъединица 30 — 40S РНК имеет одинаковые концевые последовательности и примерно одинаковые размеры. Естественно, возникает вопрос о генетической идентичности или различии этих субъединиц.

В первом случае геном онкорнавируса будет сегментарно-полиплоидным, а во втором — сегментарно-гаплоидным, т. е. каждая субъединица такого генома будет нести собственную генетическую информацию. Для определения последовательности нуклеотидов, или «композиционной сложности» (sequence complexity), в субъединицах 30 — 40S РНК используют несколько подходов.

В первую очередь заслуживает внимания метод, основанный на определении кинетики ренатурации меченой вируоспецифической ДНК, синтезированной с избытком вирусной РНК in vitro с помощью обратной транскриптазы. Кинетика образования двунитевых комплексов в этом случае зависит от длины и состава субъединиц РНК и может иметь разный характер.

Второй метод основан на измерении молярного количества олигонуклеотидов, образующихся при гидролизе РНКазой Т1 высокомолекулярной вирусной РНК. Причем в некоторых случаях полученные олигонуклеотиды анализируют методом фингерпринта.

На основании многочисленных экспериментов, проведенных в этом направлении, а также учитывая исследования биологии онкорнавирусов, по-видимому, предпочтение следует отдать полиплоидной модели генома.

Этот вывод в равной мере относится как к геному вирусов С-типа, так и к геному вирионов В-типа (Friedrich et al., 1976). Генетическими методами также доказано существование полиплоидных геномов онкорнавирусов (МсСаter, 1977). Вместе с тем установлено, что сегменты 30 — 40S РНК с идентичной композиционной сложностью не являются пермутантными и характеризуются уникальным распределением олигонуклеотидов во всех субъединицах.

После обработки 35S РНК-субъединиц разных онкорнавирусов РНКазой Т1 и последующего двумерного электрофореза в полиакриламидном геле обнаруживается 11 — 29 крупных олигонуклеотидов, которые локализуются в определенных участках по отношению к поли-А-фрагменту на 3´-конце молекулы (Billeter et al., 1976).

Для определения биологических функций Billeter и соавт. (1976) использовали 5 рекомбинантов между PR — RSV — В и нетрансформирующим вирусом из субгруппы А — RAVI, которые селекционировали по способности трансформировать клетки (свойство PR — RSV — В) и расти на куриных клетках фенотипа С/В (свойство RAVI). РНК всех рекомбинантов анализировали с помощью метода фингерпринта.

Оказалось, что все они содержат участок, специфичный для PR — RSV — В, около поли-А. Следовательно, онкоген, несущий информацию, необходимую для трансформации фибробластов, расположен на 3´-конце молекулы.

С другой стороны, все рекомбинанты, потерявшие PR — RSV — В-специфичный фрагмент в середине генома, одновременно приобретают RAVI специфические последовательности, обусловливающие способность расти и репродуцироваться на клетках С/В (последовательности, кодирующие синтез белков оболочки — env-функции).

«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Количественные определения в опытах с использованием импульсной метки, а также данные, полученные с ингибиторами белкового синтеза и канаванином, говорят о том, что протеолитическое расщепление Рrlа + b является первым путем образования промежуточных предшественников обратной транскриптазы — PrRTl, 2 и 3. Вместе с тем неясно, играет ли какую-то роль этот путь расщепления в образовании продуктов gag-гена….

Определен полный аминокислотный состав р30 вирусов С-типа мышей, кошек, крыс и обезьян, свидетельствующий о сходстве этих белков по этому критерию. Белок р30 богат остатками аминокислот с полярными боковыми цепями (лизин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты или их амиды), беден цистеином, метионином, гистидином и изолейцином. Исследование первых 30 остатков с NН2-конца р30 показало высокий уровень родства…

Продолжая эти исследования, Pawson и соавт. (1977) установили, что в бесклеточной белоксинтезирующей системе (использовали либо асцитные, либо клетки L) белок, синтезируемый геномной 30 — 40S-PHK RSV, имел молекулярную массу 76 000 и осаждался антисывороткой к разрушенному вирусу и р12, р30, но не антисывороткой к gp85. Смотрите — Трансляция РНК онкорнавирусов in vivo Следовательно, Рr76 является…

В клетках, зараженных R — MuLV, идентифицировано несколько быстрометящихся нестабильных высокомолекулярных белков: Prla±b (с массой около 200 000) — предшественник р30, р15, р12, р 10 и обратной транскриптазы; Prla±b (с массой около 90 000) — предшественник gp69/71, p 15(Е) и р12(Е); Рr3 (с массой около 80 000) и Рг4 (с массой около 70 000) —…

Основная масса вирусспецифических полипептидов синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах, а часть находится во фракции свободных полирибосом, где и происходит их синтез. Методом иммунопреципитации пептидов удалось определить размеры этих полирибосом — 350S. Эта величина свидетельствует о том, что вирусные мРНК транслируются на полирибосомах, состоящих из 12 монорибосом. На полирибосомах такого размера могут транслироваться мРНК с молекулярной массой…