31 марта 2009

Определение стероидов

Стероидные гормоны обычно содержатся в сыворотке в связанном с различными белками виде. Поскольку сывороточные белки могут обладать сродством к гормону, сходным со сродством антител, используемых в радиоиммунологическом анализе, то чтобы последний дал надежные результаты, гормоны нужно сначала экстрагировать, т. е. отделить от сывороточных белков.

До широкого распространения радиоиммунологических методов кортизол и другие сходные стероиды, которые ассоциируются с кортизолсвязывающим глобулином (КСГ), определяли методами конкурентного белкового связывания, в которых использовали этот белок-переносчик. В настоящее время такой подход применяют реже, поскольку при этом приходится характеризовать каждую партию сыворотки, из которой извлекают КСГ, и требуется более детальное разделение стероидов с помощью тонкослойной хроматографии.

Необходимость всех этих начальных этапов исследования, требующих дополнительного времени, а также более широкий разброс результатов от анализа к анализу отодвинул данный метод на второй план по отношению к радиоиммунологическому.

Наиболее распространенным средством разделения связанных с антителами и свободных стероидных гормонов является покрытый декстраном уголь. Он адсорбирует стероиды, не связанные с антителами, и переводит их в осадок. Растворимый же комплекс гормон—антитело остается в супернатанте.

В системах определения стероидов, в которых используется гормон, меченный тритием, супернатант можно декантировать в сосуд, содержащий жидкий сцинтиллятор. В некоторых системах определения стероидных гормонов используют меченые тирозилированные стероиды. В этих случаях разделение связанного и свободного гормона проводят обычно методом двойных антител.

«Эндокринология и метаболизм», Ф.Фелиг, Д.Бакстер

Читайте далее:



В отношении взаимодействия антигена с антителами принимаются некоторые допущения: присутствующий гормон гомогенен и взаимодействует с антителами с равным сродством независимо от того, содержит он радиоактивную метку или нет; присутствующие антитела гомогенны и одна молекула антитела взаимодействует с одной молекулой гормона; два разных вида молекул — гормон и антитела — реагируют до тех пор, пока между…

После высвобождения из железы некоторые гормоны быстро распадаются и циркулируют в крови в виде фрагментов. Лучше всего это видно, вероятно, на примере ПТГ, который вскоре после выделения в кровь распадается на аминоконцевой и карбоксильноконцевой фрагменты. Последний фрагмент имеет гораздо более длительный период полужизни в крови, чем аминоконцевой. Однако биологической гормональной активностью обладает именно аминоконцевой фрагмент….

Наиболее широко применяемым методом йодирования белков является, вероятно, модифицированный метод, предложенный Greenwood, Hunter и Glover. В нем используется окисляющий агент хлорамин Т, превращающий Na125I в свободный йод, который затем включается главным образом в остатки тирозина. При использовании этого метода могут йодироваться и остатки гистидина. Для сохранения максимальной иммунореактивности необходимо, чтобы на молекулу гормона приходился только…

Поскольку концентрация гормонов в сыворотке может изменяться в зависимости от времени суток, позы больного, метаболического состояния и собственного ритма с периодичностью от нескольких минут до нескольких недель, отбор проб необходимо производить в одинаковых условиях. О нормальных колебаниях уровня данного гормона судят обычно на основании анализа проб, собранных в стандартных условиях. Должно быть совершенно ясным, что…

С помощью хлорамина Т йодируют промежуточное соединениесложный эфир, образованный Nоксисукцинимидом и 3(роксифенил)пропионовой кислотой, которое затем конденсируется с аминогруппами полипептидного гормона. Такой подход позволяет избежать воздействия на гормон сильных окислителей или восстановителей. Эта методика несколько громоздка и пока не получила широкого распространения. Участки, «узнающие» гормон, могут содержать разные аминокислотные области легких и тяжелых цепей иммуноглобулина. Легкие…