26 июня 2012

Быстрометящиеся нестабильные высокомолекулярные белки

В клетках, зараженных R — MuLV, идентифицировано несколько быстрометящихся нестабильных высокомолекулярных белков: Prla±b (с массой около 200 000) — предшественник р30, р15, р12, р 10 и обратной транскриптазы; Prla±b (с массой около 90 000) — предшественник gp69/71, p 15(Е) и р12(Е); Рr3 (с массой около 80 000) и Рг4 (с массой около 70 000) — промежуточные предшественники р30, р15, р12 и р10; Рr5 (55 000) и Рr6 (45 000), содержащие пептидные последовательности р30, р15, р12 (Arcement et al., 1976, 1977).

У Рr6 отсутствуют пептиды, составляющие р15. По данным анализа триптических гидролизатов и антигенному составу белки-продукты гена gag содержатся главным образом в двух высокомолекулярных предшественниках, Рr3 и Рr4. Основной путь синтеза этих белков лежит через образование и процессинг РrЗ.

Установлено, что процесс формирования белков вирусов лейкоза мышей — gp70 и р15(Е) — отличается от процесса формирования белков ядра по трем основным признакам. Во-первых, включение как р15(Е), так и gp70 в вирионы более чувствительно к действию метаболитного аналога-2-дезокси-D-глюкозы, чем включение белков ядра.

Во-вторых, скорость появления вновь синтезированных белков оболочки в освобождающихся вирионах меньше, чем при появлении белков ядра. В-третьих, методом иммунопреципитации показано, что белки gp70 и р15 образуются из единого белкового предшественника с молекулярной массой 85 000, отличного от предшественника белков ядра (Fanmlari et al., 1976).

Несмотря на принципиальное сходство вирусспецифических белков вируса лейкоза Раушера, выявлены небольшие различия их размеров в разных типах клеток (Van Zaane et al., 1976). В зараженных клетках обнаружены два предшественника gp69/71 и р15(E).

Оба предшественника имели молекулярную массу 82 000 (env-Рr82). Предшественниками для р30 и р15 явились два белка с молекулярной массой 75 000 и 65 000 (gag-Pr75 и gag-Pr65). В присутствии аналога аргинина — канаванина в клетках вместо указанных предшественников определялись два других — gag-Pr82 и gag-Pr72.

Процессинг в присутствии канаванина замедляется. На основании этих данных предполагают, что gag-Pr82 является первичным продуктом gag-гена и очень быстро расщепляется, превращаясь при этом в gag-Pr75.

Barbacid и соавт. (1976), определяя размер и состав вирусного полипептида — предшественника онкорнавирусов С-типа млекопитающих, пришли к заключению, что продукт трансляции gag-гена является полипептидом Рг65, при расщеплении которого образуется 4 вирионных белка: р30, р15, р12 и р10.

Для установления взаимной локализации этих белков в полипептиде-предшественнике и порядка последовательностей, кодирующих эти белки внутри вирусного генома, использовали иммунологический метод. Оказалось, что последовательности в геноме, кодирующие эти белки, располагаются следующим образом: (5´)р15 — р12 — р30 — р10(3´).

Дальнейшее исследование внутриклеточных белков-предшественников R — MuLV показало, что предшественники Рг1а + b с массой около 200 000 осаждаются как антисывороткой против любого из белков gs-комплекса (р30, р15, р12 и р10), так и антисывороткой против вирусной обратной транскриптазы (Jamjoom et al., 1977). Это означает, что данные полипептиды содержат детерминанты продуктов gag- и pol-генов. Два импульсномеченых полипептида Рr3 (с массой 80 000 — 85 000) и продукт его разрезания Рr4 (с массой около 65 000 — 70 000) осаждаются анти-р30, -р15, -р12 и –р10-сыворотками, но не антиревертазной сывороткой. Следовательно, Рr3 и Рr4 представляют собой белок-предшественник — продукт gag-гена.

Три других полипептида PrRT1 (с массой около 145 000), PrRT2 (с массой около 135 000) и РrRTЗ (с массой 80 000 — 85 000) осаждаются только сывороткой против обратной транскриптазы.

Антисыворотка к gp69/71 преципитировала гликопротеид — предшественник Рr2а+b (с массой 90 000), но ни один из указанных выше полипептидов.


«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Количественные определения в опытах с использованием импульсной метки, а также данные, полученные с ингибиторами белкового синтеза и канаванином, говорят о том, что протеолитическое расщепление Рrlа + b является первым путем образования промежуточных предшественников обратной транскриптазы — PrRTl, 2 и 3. Вместе с тем неясно, играет ли какую-то роль этот путь расщепления в образовании продуктов gag-гена….

Определен полный аминокислотный состав р30 вирусов С-типа мышей, кошек, крыс и обезьян, свидетельствующий о сходстве этих белков по этому критерию. Белок р30 богат остатками аминокислот с полярными боковыми цепями (лизин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты или их амиды), беден цистеином, метионином, гистидином и изолейцином. Исследование первых 30 остатков с NН2-конца р30 показало высокий уровень родства…

Продолжая эти исследования, Pawson и соавт. (1977) установили, что в бесклеточной белоксинтезирующей системе (использовали либо асцитные, либо клетки L) белок, синтезируемый геномной 30 — 40S-PHK RSV, имел молекулярную массу 76 000 и осаждался антисывороткой к разрушенному вирусу и р12, р30, но не антисывороткой к gp85. Смотрите — Трансляция РНК онкорнавирусов in vivo Следовательно, Рr76 является…

Основная масса вирусспецифических полипептидов синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах, а часть находится во фракции свободных полирибосом, где и происходит их синтез. Методом иммунопреципитации пептидов удалось определить размеры этих полирибосом — 350S. Эта величина свидетельствует о том, что вирусные мРНК транслируются на полирибосомах, состоящих из 12 монорибосом. На полирибосомах такого размера могут транслироваться мРНК с молекулярной массой…

На различных системах клеток, нормальных и трансформированных (спонтанно и под воздействием концерогенных факторов разной природы), были установлены три типа экспрессии вирусного генома, включенного в хромосомы и начавшего функционировать и реплицироваться вместе с генами хозяина. К первому типу относятся полная транскрипция и трансляция вирусного генома, обусловливающая спонтанную продукцию инфекционного вируса, второй тип характеризуется частичной экспрессией вирусной…