11 июня 2012

Уровень активности ревертазы

Уровень активности ревертазы пропорционален количеству вирусных частиц. Минимальная активность (по числу включенных пикомолей дГТФ на одну вирусную частицу за 1 ч) составила 28,1±4,2Х10-7 для AMV и 1,1±0,2X10-7 для Ra — MuLV (Liebes et al., 1976).

Очищенная полимераза AMV служит субстратом в реакции фосфорилирования, катализируемой очищенной протеинкиназой из того же источника (Tsiapalis, 1977). Степень фосфорилирования регулирует активность ревертазы и, очевидно, правильность считывания матрицы.

Обнаружено, что отношение концентраций ревертазы и матрицы влияет как на количество, так и на качество синтезируемого транскрипта.

Ревертаза AMV не способна удалять ошибочно спаренные нуклеотиды и в процессе полимеризации, и в его отсутствии (Battula, Loeb, 1976). Обратная транскриптаза использует ошибочно спаренные инициирующие концы, находящиеся в комплексе с рибо- и дезоксирибополимерными матрицами. Эффективность использования обычных и ошибочно спаренных концов примерно одинакова, так как степень синтеза и величина продуктов, синтезирующихся в этих реакциях, одни и те же.

На основании экспериментальных данных, накопленных за последние годы, можно сформулировать следующие признаки, наличие которых необходимо для доказательства истинной РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности.

  1. Обратная транскриптаза должна быть ассоциирована с фракцией вирусных частиц с плотностью 1,16 — 1,18 г/мл. Для проявления максимальной активности фермента необходим неионный детергент (для каждого типа вируса существует строго определенная концентрация детергента типа NP-40, необходимая для образования нуклеотидов).
  2. Ферментативная активность после обработки вирионов детергентами выявляется в зоне с плотностью 1,22 — 1,24 г/мл, т. е. в зоне, в которой обнаруживается нуклеотид вируса, содержащий фермент и 70S РНК.
  3. Ревертаза должна катализировать эндогенный синтез ДНК, чувствительный к РНКазе, поскольку синтез происходит на РНК-матрице.
  4. Продукт полимеразной реакции должен (хотя бы частично) представлять собой гибрид ДНК — РНК и гибридизироваться с РНК из тех же вирусных частиц.
  5. Очищенная ревертаза из этих частиц (детергенты т высоких концентрациях разрушают нуклеоиды, при этом освобождается ДНК-полимераза) должна использовать синтетические рибо- и дезоксирибополимеры или их гибриды, а также природные экзогенные мРНК в качестве матриц. Ферментативная активность в этом случае обнаруживается в зоне градиента плотности сахарозы 1,1 г/мл.
  6. Наиболее специфической матрицей должна быть 70S РНК из онкорнавирусов.
  7. 3Н-ДНК-продукт, синтезированный на матрице 70S РНК, должен гибридизироваться с мРНК и не гибридизироваться с гетерологичной РНК.
  8. Очищенная ревертаза из онокрнавирусов должна давать определенный ответ на различные синтетические матрицы, например, в присутствии Mg2+ предпочитать олиго-дТ: поли-рА в значительно большей степени, чем олиго-дТ: поли-дА.
  9. Вирусная очищенная ревертаза должна использовать естественные РНК, РНК — ДНК-гибриды и ДНК в качестве матриц-затравок.

Вместе с тем показано, что существуют онкорнавирусы, которые могут обладать дефектными или «нестандартными» ревертазами. К таким вирусам прежде всего следует отнести вирус лейкоза хомяков (HaLV), обратная транскриптаза которого, с одной стороны, структурно отлична от всех полимераз известных онкорнавирусов, а с другой, не обладает эндогенной активностью.

Ревертаза HaLV не способна транскрибировать не только 60 — 70S РНК HaLV, но глобулиновую 9S РНК. В то же время фермент AMV транскрибирует обе эти матрицы, что указывает на способность 60 — 70S РНК HaLV функционировать в качестве матрицы.

Оказалось, что ревертаза из MSV, выращенного в крысиных клетках линии 78А1, синтезирует лишь односпиральную ДНК, фермент интрацистеральных вирусных частиц А-типа может в основном синтезировать политимлдиновую кислоту, а полимераза онкорнавирусов С-типа из спонтанной лимфосаркомы мышей линии СС57Вг — только ДНК — РНК-гибриды (А. Г. Татосян и др., 1977).

При анализе продуктов реакции в равновесном градиенте Cs24 в последнем случае обнаружено, что ДНК-продукт остается в ассоциации с РНК-матрицей в зоне с плотностью 1,66 т/мл и, вероятно, именно этим (т. е. невозможностью расхождения матрицы и продукта) объясняется остановка тюлимеразной реакции.


«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Количественные определения в опытах с использованием импульсной метки, а также данные, полученные с ингибиторами белкового синтеза и канаванином, говорят о том, что протеолитическое расщепление Рrlа + b является первым путем образования промежуточных предшественников обратной транскриптазы — PrRTl, 2 и 3. Вместе с тем неясно, играет ли какую-то роль этот путь расщепления в образовании продуктов gag-гена….

Определен полный аминокислотный состав р30 вирусов С-типа мышей, кошек, крыс и обезьян, свидетельствующий о сходстве этих белков по этому критерию. Белок р30 богат остатками аминокислот с полярными боковыми цепями (лизин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты или их амиды), беден цистеином, метионином, гистидином и изолейцином. Исследование первых 30 остатков с NН2-конца р30 показало высокий уровень родства…

Основная масса вирусспецифических полипептидов синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах, а часть находится во фракции свободных полирибосом, где и происходит их синтез. Методом иммунопреципитации пептидов удалось определить размеры этих полирибосом — 350S. Эта величина свидетельствует о том, что вирусные мРНК транслируются на полирибосомах, состоящих из 12 монорибосом. На полирибосомах такого размера могут транслироваться мРНК с молекулярной массой…

Продолжая эти исследования, Pawson и соавт. (1977) установили, что в бесклеточной белоксинтезирующей системе (использовали либо асцитные, либо клетки L) белок, синтезируемый геномной 30 — 40S-PHK RSV, имел молекулярную массу 76 000 и осаждался антисывороткой к разрушенному вирусу и р12, р30, но не антисывороткой к gp85. Смотрите — Трансляция РНК онкорнавирусов in vivo Следовательно, Рr76 является…

В клетках, зараженных R — MuLV, идентифицировано несколько быстрометящихся нестабильных высокомолекулярных белков: Prla±b (с массой около 200 000) — предшественник р30, р15, р12, р 10 и обратной транскриптазы; Prla±b (с массой около 90 000) — предшественник gp69/71, p 15(Е) и р12(Е); Рr3 (с массой около 80 000) и Рг4 (с массой около 70 000) —…