8 июня 2012

Синтез вирусной ДНК при заражении онкорнавирусами птиц

Установлено, что синтез вирусной ДНК при заражении онкорнавирусами птиц чувствительных клеток в зависимости от множественности инфекции обнаруживается через 1 — 9 ч и продолжается до 48 ч, затем снижается. Интеграция начинается через 16 ч, а количество вирусной ДНК, ассоциированной с клеточной ДНК, возрастает до 72 ч после чего остается на достигнутом уровне.

Процесс синтеза вирусной ДНК и ее интеграция носят сходный характер как для AMV (продуктивная инфекция), так и для RSV (трансформация). Показано, что вирусная ДНК синтезируется в виде линейных молекул с массой ЗХ106 (что соответствует размеру одной субъединицы), которые затем ковалентно связываются с клеточной ДНК.

На 13-й час инфекции обнаруживается, например, от 3 до 10 дополнительных копий RAV2 на гаплоидный геном (в незараженных куриных клетках содержится 7 копий последовательностей, гомологичных части генома RAV2), т. е. количество хромосомной ДНК в 10 000 раз и более превышает количество вирусной ДНК.

Этот показатель не возрастает при увеличении множественности и остается постоянным до 20 ч, после чего наблюдается резкое возрастание количества вирусной ДНК в клетках. Между 20-м и 40-м часом в клетках накапливается до 100 копий на гаплоидный набор клеточной ДНК. Большинство этих вирусных ДНК находится в неинтегрированном состоянии и постепенно элиминируется в процессе пассирования до 1 — 3 дополнительных копий.

Причем эти оставшиеся копии стабильно интегрированы в клеточную ДНК (Khoury, Hanafusa, 1976). Представленные данные согласуются с предположением о том, что куриные клетки содержат ограниченное число мест интеграции для генома онкорнавирусов.

В утиных клетках (пермиссивная система), трансформированных В77 — RSV, в ядерной фракции содержатся 6 — 7 копий, а в цитоплазме — 10 копий вирусной ДНК. Varmus и соавт. (1976) инкубировали такие клетки с бромдезоксиуридином и в течение 24 ч экстрагировали ДНК из ядерной и цитоплазматической фракции, определяя ее плавучую плотность центрифугированием в градиенте CsCl.

Оказалось, что основная масса вирусной ДНК в цитоплазме (около 80%) содержит бромдезок-сиуридин в обеих нитях, т. е. синтезируется в течение 24 ч, часть ДНК обнаруживается и в зоне с промежуточной плотностью.

В противоположность этому ядерная вирусная ДНК коседиментирует с нереплицирующейся клеточной ДНК.

Полностью трансформированные клетки уток, а также утиные фибробласты через 20 — 72 ч после инфицирования RSV содержат как интегрированную, так и неинтегрированную вирусную ДНК.

Через 20 ч после заражения определяется более одной копии вирусной ДНК на клетку. В полностью трансформированных клетках находятся 4 — 8 копий на клетку.


«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Количественные определения в опытах с использованием импульсной метки, а также данные, полученные с ингибиторами белкового синтеза и канаванином, говорят о том, что протеолитическое расщепление Рrlа + b является первым путем образования промежуточных предшественников обратной транскриптазы — PrRTl, 2 и 3. Вместе с тем неясно, играет ли какую-то роль этот путь расщепления в образовании продуктов gag-гена….

Определен полный аминокислотный состав р30 вирусов С-типа мышей, кошек, крыс и обезьян, свидетельствующий о сходстве этих белков по этому критерию. Белок р30 богат остатками аминокислот с полярными боковыми цепями (лизин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты или их амиды), беден цистеином, метионином, гистидином и изолейцином. Исследование первых 30 остатков с NН2-конца р30 показало высокий уровень родства…

Основная масса вирусспецифических полипептидов синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах, а часть находится во фракции свободных полирибосом, где и происходит их синтез. Методом иммунопреципитации пептидов удалось определить размеры этих полирибосом — 350S. Эта величина свидетельствует о том, что вирусные мРНК транслируются на полирибосомах, состоящих из 12 монорибосом. На полирибосомах такого размера могут транслироваться мРНК с молекулярной массой…

Продолжая эти исследования, Pawson и соавт. (1977) установили, что в бесклеточной белоксинтезирующей системе (использовали либо асцитные, либо клетки L) белок, синтезируемый геномной 30 — 40S-PHK RSV, имел молекулярную массу 76 000 и осаждался антисывороткой к разрушенному вирусу и р12, р30, но не антисывороткой к gp85. Смотрите — Трансляция РНК онкорнавирусов in vivo Следовательно, Рr76 является…

В клетках, зараженных R — MuLV, идентифицировано несколько быстрометящихся нестабильных высокомолекулярных белков: Prla±b (с массой около 200 000) — предшественник р30, р15, р12, р 10 и обратной транскриптазы; Prla±b (с массой около 90 000) — предшественник gp69/71, p 15(Е) и р12(Е); Рr3 (с массой около 80 000) и Рг4 (с массой около 70 000) —…