31 мая 2012

Сравнение недефектного (nd)RSV и RSV штамма

При сравнении недефектного (nd)RSV (штамм Шмидта — Руппина SR) и RSV штамм N8 (неспособного синтезировать гликопротеид вирусной оболочки) установлено, что 7 — 8 олигонуклеотидов, выявляемых в nd — SR — RSV, но отсутствующих в N 8 — RSV, образуют общий сегмент, который включает около 2200 нуклеотидов. Этот сегмент расположен на расстоянии 2800 — 5000 нуклеотидов от поли-А-конца (Wang Lu-Hai et al., 1976). В nd — SR — RSV по сравнению с дефектным по трансформации (td) SR — RSV обнаружены два дополнительных олигонуклеотида, которые, по-видимому, представляют собой sarc-ген.

Этот фрагмент локализуется между поли-А и участком, отсутствующим в N 8 — RSV. Во всех исследованных штаммах RSV выявлен общий фрагмент — участок С, располагающийся непосредственно за поли-А и присутствующий как в РНК вируса дикого типа, так и td-мутанта.

Итак, с помощью указанного метода сегменты вирусной РНК химически идентифицируются по содержанию крупных олигонуклеотидов, устойчивых к РНКазе. Затем определяют локализацию полученных олигонуклеотидов относительно поли-А-конца, начиная с самого мелкого фрагмента, содержащего поли-А.

Полученный порядок расположения олигонуклеотидов характеризуется как олигонуклеотидная карта. Генетические функции олигонуклеотидов идентифицируют с помощью трех тестов.

  1. Олигонуклеотиды, присутствующие в недефектных вирионах, но отсутствующие в соответствующих делекционных мутантах, определены ответственными за экспрессию этой функции в вирионах дикого типа.
  2. Вирусные рекомбинанты содержат специфический набор олигонуклеотидов от родителей, и следовательно, генетические функции определенных олигонуклеотидов могут быть идентифицированы, если эти олигонуклеотиды сегрегируют с родительского маркера в рекомбинант.
  3. Определенные вирусные олигонуклеотиды обнаруживаются во всех онковирусах, и если их функции известны, то их можно локализовать на карте.

На основании имеющихся данных, частичную генетическую карту RSV, координированную в отношении нуклеотидов (в 10-2), можно представить следующим образом: на 3´-кояце 0 — 2, поли-А длиной 150 — 200 нуклеотидов; 2 — 6,5, участок С; 6,5 — 20, sarc-ген; 20 — 28, сегмент, присутствующий в nd — SR — RSV, N 8 — RSV и td — SR — RSV; 28 — 50, последовательности, специфичные для гена белков оболочки — гликопротеидов (env); 50 — 100, гены, кодирующие синтез внутренних структурных группоспецифических белков (gag) и полимеразы (pol). Располагаются они в следующем порядке: 5´-gag — pol — env — sarc — поли-А — 3´, на 5´-конце находится участок связывания с РНК-затравкой (Billeter et al., 1976; Wang Lu-Hai et al., 1976). Аналогичная последовательность генов имеет место и в РНК онкорнавирусов млекопитающих (Many, 1977).

Методом гибридизации 3Н-ДНК-продукта, синтезированного на РНК MuLV, и РНК из различных типов клеток установлено, что в геноме онкорнавирусов мышей С-типа имеется фрагмент, присутствующий во всех репликационно-дефектных вирусах (Parks et al., 1976).

Этот общий фрагмент, вероятно, тесно связан с трансформирующими функциями и составляет 15% генома MuLV. Эти данные позволяют предполагать, что рекомбинационный акт, приводящий к образованию трансформирующих вирусов, происходит на общем участке генома.

Используя гибридизацию полного 3Н-ДНК-транскрипта MuLV с РНК из различных клеток, Parks и соавт. (1976) получили меченые ДНК-копии, специфичные для определенных областей генома:

  1. gp70 еnυ-ген,
  2. общего фрагмента FT+ (онкогена) трансформирующих вирусов,
  3. gag-ген белков р30, р15, р12 и р10.

Таким образом, осуществлено картирование делеций, связанных с репликацией в геноме трансформирующих онкорнавирусов С-типа мышей.

«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Количественные определения в опытах с использованием импульсной метки, а также данные, полученные с ингибиторами белкового синтеза и канаванином, говорят о том, что протеолитическое расщепление Рrlа + b является первым путем образования промежуточных предшественников обратной транскриптазы — PrRTl, 2 и 3. Вместе с тем неясно, играет ли какую-то роль этот путь расщепления в образовании продуктов gag-гена….

Определен полный аминокислотный состав р30 вирусов С-типа мышей, кошек, крыс и обезьян, свидетельствующий о сходстве этих белков по этому критерию. Белок р30 богат остатками аминокислот с полярными боковыми цепями (лизин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты или их амиды), беден цистеином, метионином, гистидином и изолейцином. Исследование первых 30 остатков с NН2-конца р30 показало высокий уровень родства…

Основная масса вирусспецифических полипептидов синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах, а часть находится во фракции свободных полирибосом, где и происходит их синтез. Методом иммунопреципитации пептидов удалось определить размеры этих полирибосом — 350S. Эта величина свидетельствует о том, что вирусные мРНК транслируются на полирибосомах, состоящих из 12 монорибосом. На полирибосомах такого размера могут транслироваться мРНК с молекулярной массой…

Продолжая эти исследования, Pawson и соавт. (1977) установили, что в бесклеточной белоксинтезирующей системе (использовали либо асцитные, либо клетки L) белок, синтезируемый геномной 30 — 40S-PHK RSV, имел молекулярную массу 76 000 и осаждался антисывороткой к разрушенному вирусу и р12, р30, но не антисывороткой к gp85. Смотрите — Трансляция РНК онкорнавирусов in vivo Следовательно, Рr76 является…

В клетках, зараженных R — MuLV, идентифицировано несколько быстрометящихся нестабильных высокомолекулярных белков: Prla±b (с массой около 200 000) — предшественник р30, р15, р12, р 10 и обратной транскриптазы; Prla±b (с массой около 90 000) — предшественник gp69/71, p 15(Е) и р12(Е); Рr3 (с массой около 80 000) и Рг4 (с массой около 70 000) —…