Исследуемые сыворотки разводят 1:10 с помощью кроличьей сыворотки (в разведении 1:250), подогревают в электрической водяной бане при 54 °С в течение 20 мин (для разрушения комплемента) и охлаждают. Затем к ним добавляют формалинизированные или свежие эритроциты барана из расчета 0,2 мл на 1 мл сыворотки, содержимое пробирки встряхивают и помещают на 30 мин в термостат при 37 °С. Сыворотки с эритроцитами на ночь помещают в холодильник при 4 °С. На следующий день сыворотки отбирают пипеткой, а осадок эритроцитов удаляют.
РПГА проводят в полистироловых пластинках.
В первые лунки наливают по 0,4 мл исследуемых сывороток в разведении 1:10, в последующие лунки — двукратные их разведения до 1:5120.
В каждую лунку добавляют 0,05 мл соответствующего диагностикума — эритроциты барана, сенсибилизированные антигенами (Аг).
РПГА учитывают на следующий день. Полную агглютинацию оценивают + + + +, почти полную + + +. Положительной считают агглютинацию + + + или + + + +. Титры РПГА выражают как эквивалент самого высокого разведения (+ + + или + + + +).
Контролем служат разведения исследуемых сывороток с несенсибилизированными эритроцитами и взвесь сенсибилизированных эритроцитов в кроличьей сыворотке (в разведении 1:250, контроль Аг). Для подтверждения специфичности РПГА ставят реакцию торможения гемагглютинации. К последовательным двукратным разведениям исследуемых сывороток прибавляют соответствующий Аг, встряхивают содержимое пластинок и ставят их на 1 ч в термостат при 37 °С, затем добавляют диагностикум — эритроциты барана, сенсибилизированные соответствующими Аг, и снова встряхивают. В контроле РПГА должна быть отрицательной.
Приготовление Аг для сенсибилизации эритроцитов в РПГА. У всех больных каждые 7 — 10 дней производят посев мочи. Выделенные микробы сохраняют, из их суточных культур готовят Аг. Культуры выращивают на пластинах 1,5% слабощелочного агара.
На следующий день их смывают стерильным изотоническим раствором хлорида натрия (рН 7,0) и доводят до концентрации 10 млрд. микробных тел в 1 мл мочи по оптическому стандарту мутности. Микробные взвеси прогревают в течение 2 ч в кипящей водяной бане и охлаждают. Отсутствие роста высеянной микробной взвеси служит доказательством того, что микробы были убиты. Несколько приготовленных Аг одного вида микробов от разных больных сливают вместе, центрифугируют и надосадочную жидкость используют в качестве Аг.
Для определения антибактериальных антител в сыворотке крови в контрольной группе детей применяют поливалентные Аг бактерий кишечной, синегнойной палочки, протея, энтерококка, белого стафилококка, которые получают сливанием убитых культур микробов от разных больных. Приготовленные Аг до использования хранят в холодильнике.
«Детская урология», Н.А. Лопаткин