Для исследования используют утреннюю порцию мочи. С целью очищения мочи от ингибиторов мочу подвергают диализу в коллодиевых или целлофановых мешочках. Для диализа можно использовать дистиллированную воду, фосфатные буферы или проточную водопроводную воду.
Для определения общей активности мочевой ЛДГ необходимы следующие реактивы: фосфатный буфер (рН 7,2) Ма2НРО4 * 0,8 мл 1/ 15 К2Н2РО4 (72 мл), пируват натрия 4,1 * 10-3 М (0,45 мг пирувата на 1 мл фосфатного буфера), НАДН2 10,6 * 10-3 М (8,3 мг на 1 мл буфера), 1 М НС1, 1 М NaOH, индикаторная бумага (химические реактивы готовят непосредственно перед проведением исследования).
В течение 15 мин при 3000 об/мин центрифугируют 10 мл мочи. Надосадочную жидкость сливают в другую центрифужную пробирку и в ней с помощью индикаторной бумаги определяют рН. Осторожным добавлением капли НС1 или NaOH (в зависимости от исходной реакции мочи) доводят рН мочи до 7,2.
Затем жидкость подвергают центрифугированию в рефрижераторной центрифуге при 4 °С и 10 000 об/мин в течение 30 мин. Затем мочу диализируют в течение 80 мин. К 0,1 мл диализата добавляют 2850 мм Sodium pyruvate и 50 мм КаДН2. Смесь в пробирке тщательно смешивают и выливают в кювету спектрофотометра, после чего регистрируют оптическую плотность определяемого раствора (отечественный спектрофотометр СФ-4 или СФД-2 с использованием УСФ-2).
Расчет ведут по формуле: E=((a-b)*10*1000)/30,
где:
-
а — оптическая плотность раствора до инкубации;
-
b — после инкубации;
-
10 — коэффициент пересчета на 1 мл мочи;
-
1000 — коэффициент перевода в единицы Вроблевского;
-
30 — время инкубации (мин).
«Детская урология», Н.А. Лопаткин