В цитоплазме культуры ФЭК, инфицированной онковирусом А12, ЛДГ5 не найдена, а ЛДГ4 исчезала на 18-й и 24-й дни инфекции. В остальные дни активность фермента была меньше как по сравнению с нормой, так и по сравнению с активностью в клетках ФЭК, зараженной вирусом А6.
Активность ЛДГ1 существенно снизилась в цитоплазме на 24-й день (в 1,6 раза), а ЛДГЗ уменьшилась в 1 1/2 раза на 18-й день и 1,3 раза на 24-й день как по сравнению с нормой, так и с активностью в клетках ФЭК, зараженной А6. В ядерной фракции на 5-й и 18-й дни после инокуляции вируса А12 в культуру ФЭК было обнаружено достоверное увеличение активности МДГ1, активность МДГ2 повышалась на 3-й, 5-й и 8-й дни, а МДГЗ — на 3-й и 24-й дни.
В цитоплазме под действием онковируса активность МДГЗ возрастала на 3-й и 24-й дни инфекции.
Таким образом, действие инфекционных и онкогенных вирусов вызывает перестройку в изоферментных спектрах ферментов энергетического обмена как в ядерной фракции, так и в цитоплазме.
Эти нарушения обнаруживаются с первых дней взаимодействия клеток культуры ФЭК с вирусом. Ори контакте с онкогенным вирусом ОЙИ выражены больше, чем при контакте с инфекционным.
Повышение активности некоторых ферментов энергетического обмена в цитоплазме (по сравнению с ядерной фракцией) при заражении инфекционным и онкогенным вирусами, вероятно, можно объяснить более высоким уровнем гликолитических процессов, стимулированных онковирусом в трансформированных клетках. Важно подчеркнуть, что эти сдвиги в регуляции синтеза изоформ исследованных ферментов не связаны с пролиферативным ростом культуры клеток, а обусловлены именно воздействием вируса на клетку. Возможно, они происходят вследствие эпигеномной перестройки под влиянием онковируса.
Особый интерес представляют данные сравнительного анализа сдвигов в изоформах исследуемых ферментов в культурах клеток ФЭК, инфицированных вирусом А12, и в клетках сарком А12 и ретикулосарком 321-КРС, растущих in vitro.
Установлено, что в клетках саркомы А12 в ядерной фракции преобладает гексокиназа 3. Общая активность фермента в цитоплазме клеток была выше, чем в ядре. Аналогичные сдвиги отмечены нами и в процессе трансформации клеток ФЭК, инфицированных этим же вирусом.
Смотрите рисунок — Активность ПК
Смотрите рисунок — Электрофореграммы и денситограммы изоферментов ГК (1 — 3) в глобулиновой фракции ядер клеток культуры ФЭК
Изоферменты ГК (1 — 3) в саркоме хомяка, индуцированной аденовирусом 12-го типа
а — в ядерной фракции iv vitro; б — в системе in vivo; в — в цитоплазме in vivo.
Изоферменты ГК (1 — 3) в крысиной ретикулосаркоме КРС — 321
а, б, в — то же, что на рисунке выше.
Электрофореграммы и денситограммы изоферментов ГК (1 — 3)
в саркоме хомяка, индуцированной вирусом А12
а — в растворимой ядерной фракции; 6 — в цитоплазме.
Изоферментный спектр ЛДГ в ядрах клеток саркомы А12 представлен двумя формами, из которых преобладала ЛДГ1. В цитоплазме выявлены 4 изофермента.
Изоферменты ЛДГ (1 — 4) в саркоме хомяка
В ядерной фракции системы; а — in vivo; б — in vitro; в цитоплазме; в — in vivo; г — in vitro.
Малатдегидрогеназа в ядре в цитоплазме клеток саркомы А12 представлена тремя изоферментами. В ядерной фракции их количество примерно одинаковое, а в цитоплазме преобладала МДГЗ.
Изоферменты МДГ (1 — 3) в саркоме хомяка
а — в ядерной фракции in vitro; б — в системе in vivo; в — в цитоплазме in vivo; r — в культуре.
Для ретикулосаркомы крыс 321-КРС общая активность гексокиназы в цитоплазме клеток была выше, чем в ядре (8,5 и 2,8 мкмоль).
В ядерной фракции преобладала гексокиназа 3.
Смотрите рисунок — Изоферменты ГК (1 — 3) в крысиной ретикулосаркоме КРС — 321
Электрофореграммы и денситограммы изоферментов ГК (1 — 3) в крысиной ретикулосаркоме КРС-321 in vivo
а — в ядерной фракции; б — в цитоплазме.
Изоферментный спектр ЛДГ в клетках этой саркомы был представлен двумя изоферментами как в цитоплазме, так и в ядерной фракции. Активность каждого из изоферментов (ЛДП и ЛДГ2) в ядре была выше их активности в цитоплазме в культуре.
Изоферменты ЛДГ (1 — 2) в крысиной ретикулосаркоме КРС-321
В ядерной фракции системы: а — in vivo; б — in vitro; в цитоплазме: в — in vivo; г — in vitro.
Электрофореграммы и денситограммы изоферментов ЛДГ (1 — 2)
в крысиной ретикулосаркоме КРС-321 in vivo
а — в ядерной фракции; б — в цитоплазме.
Малатдегидрогеназа в клетках саркомы 321-КРС выявлена в трех формах и в ядерной фракции, и в цитоплазме. В ядерной фракции содержание МДГЗ было значительно ниже, чем количество двух других изоферментов. В цитоплазме клеток преобладала МДГ2. Оказалось, что в ядерной фракции уровень МДГ1 и МДГЗ был выше, чем уровень этих изоферментов в цитоплазме клеток культур.
Изоферменты МДГ (1 — 3) в крысиной ретикулосаркоме КРС-321
а, б, в, г — то же, что на рисунке выше.
Смотрите рисунок — Изоферменты ЛДГ (1 — 2) в крысиной ретикулосаркоме КРС-321
Электрофореграммы и денситограммы изоферментов МДГ (1 — 3)
в крысиной ретикулосаркоме КРС-321 in vivo
а, б — то же, что на рисунке выше.
Смотрите рисунок — Электрофореграммы и денситограммы изоферментов ЛДГ (1 — 2) в крысиной ретикулосаркоме КРС-321 in vivo
Таким образом, исследование в динамике молекулярных форм ферментов энергетического обмена в культуре, зараженной онкогенным аденовирусом 12-го тина, и в саркомах А12 и 321-КРС позволило выявить общие черты в изменении каждого из изученных ферментов. Наиболее контрастными были изменения гексокиназы. Прежде всего они выражались в повышенном содержании фермента в цитоплазме по сравнению с его уровнем в ядре клеток культуры ФЭК при появлении очагов морфологической трансформации.
Отмечено преобладание гексокиназы 3 над другими изоферментами в ядерной фракции. Идентичные результаты получены и на других тест-системах. Так, значительное повышение относительного содержания гексокиназы 3 в клетках гепатомы Морриса коррелировало с увеличением степени злокачественности исследованных новообразований. Этот изофермент был преобладающим также в карциномах молочной железы, почки, в рабдомиосаркоме человека (В. С. Шапот, 1975).
Гексокиназе придается особое значение, так как предполагают, что в поверхностных мембранах раковых клеток локализована гексокиназа с повышенным сродством к глюкозе, вероятно, преимущественно этот изофермент выходит в окружающую среду.
Возможно, увеличение содержания гексокиназы, обеспечивающее повышение потенциальной способности к гликолизу, связано с малигнизацией клеток. В ядрах клеток ФЭК, зараженных онкогенным вирусом А12, спектр изоформ лактатдегидрогеназы более упрощен, чем в цитоплазме, за счет быстро мигрирующих изоферментов. Малатдегидрогеназа в этих же клетках представлена тремя формами как в ядре, так и в цитоплазме. В обеих фракциях содержание МДГЗ было повышено. Аналогичные изменения спектров ЛДГ и МДГ наблюдались и в культуре клеток сарком А12.
Таким образом, изменения изоферментных спектров гексокиназы, ЛДГ и МДГ в растворимой ядерной фракции и цитоплазме клеток ФЭК под влиянием ДНК-содержащего онковируса свидетельствуют об усилении гликолитических процессов, которые характерны для малигнизированной ткани.
Следовательно, обнаруженные сдвиги можно использовать в качестве объективных признаков трансформации клеток. Предполагают, что повышение активности гексокиназы и стимуляция гликолиза на ранних стадиях трансформации клеток ФЭК под действием онковируса являются основным свойством бластомогенного процесса, возможно, обусловленным нерегулируемостью процесса пролиферации клеток.
«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко