Использование кинетики реассоциации меченой вирусной ДНК в присутствии немеченой ДНК из нормальных и трансформированных вирусом полиомы и SV40 клеток хомяка и мыши позволило определить число вирусных ДНК-копий.
Для исследованных культур оно колебалось от 1 до 8,75 в расчете на диплоидный геном, в среднем выявляются два геномных эквивалента вируса. Однако, как выяснилось, частота встречаемости каждого из Нра 1-фрагментов была различна.
Например, клетки мышей SVT2, трансформированные SV40, содержали 6,52 копии фрагмента А, 0,81 — фрагмента В, 5,52 — фрагмента С и 2,04 — фрагмента D. Предполагают, что непрерывный участок генома SV40 (фрагмент В и часть фрагмента D) присутствует в трансформированных клетках в количестве 0,8 копий на диплоидное количество клеточной ДНК, в то время как остальная часть генома (фрагменты А, С и оставшаяся часть D) обнаруживаются в количестве 6 копий (Botchan et al., 1975).
В крысиных клетках, трансформированных вирусом полиомы в дополнение к 6 — 10 копиям вирусного генома, ковалентносвязанным с хромосомальной ДНК, выявлено значительное количество неинтегрированной вирусной ДНК (Prasad et al., 1976). В среднем это количество — 20 копий на клетку — находится в виде суперциркулярных двунитевых молекул, локализованных в ядрах клеток, но не ассоциированных с клеточной ДНК.
При пассировании таких клеток продукция вируса PY в них не наблюдается, но при слиянии их с чувствительными мышиными клетками в них происходит «спасение» вируса. «Свободные» молекулы вирусной ДНК определялись в клетках и в том случае, если трансформация осуществлялась вирусными ts-A- и ts-8-мутантами и клетки после этого выдерживались при температуре 33 °С. Эта «свободная» ДНК, вероятно, присутствовала во всех клетках культуры, поскольку ре-клонирование не изменяло ее уровня.
«Свободная» ДНК оказалась инфекционной, однако ее специфическая активность была в 1000 раз ниже, чем у ДНК из клеток, продуктивно зараженных вирусом PY, что указывает на значительное число дефектов в структуре «свободной» ДНК.
При инфицировании аденовирусом 2-го типа во всех трансформированных линиях клеток было обнаружено до 16% вирусного генома (онкоген) в интегрированной форме в количестве 2 — 6 копий, а в клетках, трансформированных вирусом А5, интегрировался участок, отщепляемый эндонуклеазой Нра I, составляющий около 14% левой части молекулы ДНК. Этот участок был представлен 4 — 5 копиями.
В отношении других фрагментов вирусной ДНК А5 результаты были более вариабельными, так как определялись в различных трансформированных линиях последовательности вирусного генома, отстоящие от левого конца цепи ДНК на 35, 40 и 12% от общей длины генома, т. е. в таких клетках выявлялось от 35 до 45% генома вируса А5.
Реассоциация меченой ДНК вируса А12 с экстрагируемой клеточной ДНК показала, что количество вирусной ДНК в геноме абортивно инфицированных клеток возрастает при увеличении множественности инфекции от 1 — 2 ДНК-копий А12 до 72 копий. При анализе ДНК из трансформированных вирусом А12 клеток обнаружено также наличие 14% левой части вирусного генома в количестве от 10 до 20 копий в зависимости от клеточных линий.
«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко