11 июля 2012

Гибридизационный анализ импульсно меченной РНК

Гибридизационный анализ импульсно меченной РНК показал, что в составе различных фракций аденовирусных мРНК имеются общие нуклеотидные последовательности, комплементарные одним и тем же фрагментам ДНК А2, которые, следовательно, являются общими стартовыми точками транскрипции.

Первоначальным продуктом транскрипции аденовирусной ДНК в инфицированных клетках является РНК-предшественник с высокой молекулярной массой (25 000 — 35 000 оснований). В условиях последующего блока транскрипции этот предшественник характеризуется постепенным снижением молекулярной массы и по этому признаку приближается к цитоплазматической аденовирусной мРНК.

Исследование вирусного транскрипта на ранних стадиях продуктивной инфекции (5 1/2 ч) вирусом А2 выявило, что он представляет собой двунитевую мРНК, способную к самоотжигу (Zimmer, Raskas, 1976). Эта ранняя ядерная мРНК содержала в 4 раза больше вирусных последовательностей (в том числе и поли-А), чем тотальная ядерная мРНК.

С помощью гибридизации участков ранних мРНК с поли-А-последовательностями и без них показано, что обе популяции молекул двунитевых ядерных мРНК содержат симметричные вирусные транскрипты.

Таким образом, при транскрипции аденовирусной ДНК, по-видимому, образуется высокомолекулярный предшественник, который далее подвергается специфическому процессингу и превращается в транслируемые формы мРНК. Вирусную мРНК использовали в качестве матрицы для синтеза в бесклеточных экстрактах млекопитающих. Установлено, что гены ранних белков с молекулярной массой 52 000 (44 000), 15 000, 72 000, 15 500, 18 000 и 11 000 локализованы соответственно в положениях 0 — 41; 4,1 — 16,7; 58,5 — 70,7; 75,9 — 83,4 и 89,7 — 98,6 ед. генетической карты генома А2. Полипептид с молекулярной массой 72 000 представляет собой одноцепочечный, связанный с ДНК белок. Построена частичная карта поздних генов вируса А2.

Показано, что поздняя цитоплазматическая мРНК стимулирует синтез 12 вирусспецифических полипептидов. Гены, кодирующие их синтез, расположены следующим образом на карте ДНК вируса А2: (III, Ilia, IVa, V, P-VII, IX), (II, P-VI), 100K, IV, при этом порядок расположения друг относительно друга компонентов, заключенных в скобки, окончательно еще не установлен (Weber, 1976). У ts-мутанта А21 (tsl), мутационный дефект которого проявляется на поздней стадии репродукции, выявлено нарушение образования полипептида-предшественника (PreVII) главного белка сердцевины аденовируса (белок VII).

Не наблюдался синтез и других предполагаемых предшественников полипептидов Va (27K) и Vb (24K). Мутация tsl в пермиссивных условиях блокирует образование шести продуктов, появляющихся в результате расщепления белков предшественников, — полипептидов VI, VII, VIII, X, XI, XII.

Считают, что tsl-reu кодирует или регулирует функцию эндопротеазы, ответственной за конечный этап морфогенеза аденовирусов, при котором происходит созревание «молодых вирионов» в зрелые инфекционные вирионы путем серии расщеплений белков-предшественников.

Последовательности аденовирусной ДНК, кодирующие структурные антигены гексона располагаются между 0,44 и 0,59 ед. генетической карты, начиная от левого конца молекулы. Это соответствует фрагменту ДНК с массой ЗХ106, который потенциально может кодировать белок с молекулярной массой 130 000.

Последовательности, кодирующие фибер, локализованы между 0,85 и 0,98 ед. карты рекомбинантов, что соответствует фрагменту ДНК с массой 2,7Х106, и потенциально могут кодировать белок с молекулярной массой 99 000.

«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Метод искусственных гетерокарионов оказался весьма эффективен для многих тест-систем клеток, трансформированных как РНК-, так и ДНК-содержащими онковирусами. В некоторых случаях индикаторные культуры использовали даже для титрования освобожденного вируса по фокусам трансформации, которые он индуцировал (Svoboda et al., 1975). Во всех этих экс-периментах чем больше был процент гетерокарионов, тем выше оказалась эффективность метода. Однако в системах,…

В экспериментах, проведенных А. И. Агеенко и соавт. (1975), из перевивных сарком (с 50-й по 60-ю генерацию), индуцированных у хомяков аденовирусом 12-го типа, полный инфекционный вирус выделялся постоянно. Обнаружено, что при заражении центрифугатами разрушенных клеток перевивных сарком культуры почки эмбриона человека (ПЭЧ) в среднем через 5 дней отмечалось начало цитогенного действия вируса. Из первичноиндуцированных сарком…

Установлена прямая пропорциональность между дозой различных агентов (митомицин С, бромдезоксиуридин, УФ- и 60Со-γ-облучение) и урожаем вируса, освобожденного из трансформированных клеток (Kaplan et al., 1975). Урожай вируса увеличивается по сравнению с контролем в 1000 — 10 000 раз. В линиях — продуцентах инфекционного SV40 доля индуцированных клеток составляла 2 — 6% (по данным определения продукции V-антигена…

Клетки, трансформированные всеми исследованными в настоящее время онкогенными ДНК-содержащими вирусами, в основном являются непермиссивными для полного репродуктивного цикла трансформирующего их вируса, и поэтому естественно, что полный инфекционный вирус ими не продуцируется. Как известно, существуют два крайних ответа пермиссивных клеток природного хозяина при взаимодействии с геномом ДНК-содержащих онковирусов — лизис и трансформация. Трансформация осуществляется тогда, когда…

Итак, по характеру взаимоотношений онковируса с трансформированной клеткой можно выделить следующие типы опухолевых клеток. Вируспродуцирующие клетки. Как правило, это относится к РНК-содержащим вирусам. Вирогенные клетки, в которых удается активировать вирусный геном с помощью различных методических приемов (трансплантации их естественным хозяевам онковируса или при использовании «контактной индукции», т. е. прямого контакта опухолевой клетки с чувствительной «индикаторной»…