Электронно-микроскопический анализ изображений гетеродуплексов с последующей ДНК — ДНК-гибридизацией показал, что Д-ДНК в основной массе представляют собой не просто О-ДНК с делециями, а содержат специфические последовательности, не гибридизирующиеся с О-ДНК.
Эти последовательности ковалентно связаны с ограниченным набором гибридизирующихся последовательностей. Причем в некоторых Д-ДНК вообще не идентифицировано последовательностей, гомологичных к О-ДНК.
Считают, что негибридизирующиеся участки в различных клоновых Д-ДНК могут как образовываться последовательностями ДНК клетки-хозяина, так и состоять из транслоцированных обратных или повторяющихся вирусных последовательностей.
Фрагменты клеточной ДНК, встроенные в вирусный геном, различны у разных вариантов Д-ДНК. Это свидетельствует о том, что рекомбинация между вирусным геномом и клеточной ДНК при литической инфекции осуществляется в нескольких участках.
С помощью метода молекулярной гибридизации показано, что клеточные фрагменты в дефектных вирионах распределены между повторяющимися сегментами вирусного генома и представляют собой как повторяющиеся, так и уникальные последовательности в отношении 1 : 3. Они не попадают в вирус вследствие случайной селекции всех последовательностей генома клеток-хозяина.
Таким образом, дефектные эволюционные варианты паповавирусов образуются в результате «вырезания» некоторых участков вирусного генома, интегрированного в клеточную ДНК и содержащего замещения из фрагментов ДНК хозяина, и последующей амплификации специфичных последовательностей вирусных ДНК до размеров, необходимых для инкапсуляции в частицы.
Исследование природы и внутримолекулярной локализации тандемно повторяющихся последовательностей ДНК неинфекционных дефектных вирусных частиц показало, что основная их часть происходит из той части генома, в которой локализуется участок (фрагменте) инициации процесса репликации (0,67 ед. карты).
Иными словами, все мутанты SV40 с повторами сохраняют и амплифицируют область репликации вирусной ДНК (Davoli et al., 1977). Наличие же нескольких копий фрагмента С создает преимущества в репликации таких дефектных молекул, которые реплицируются значительно быстрее не дефектных молекул ДНК.
Вместе с тем, несмотря на появление у эволюционных вариантов нескольких точек инициации, репликация ДНК начинается только в одной точке. Этот феномен можно объяснить существованием какого-либо лимитирующего фактора, необходимого для инициации. Возможно, что это продукт гена ASV40.
Наличие тандемно повторяющихся репликонов делает ДНК таких мутантов SV40 более активными в репликации. Это и послужило поводом для исследования их по аналогии с бактериальными плазмидами и репликоном фага X в качестве молекул-векторов для переноса, размножения и клонирования чужеродных прокариотических ДНК в животных клетках.
«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко