Установлено, что синтез вирусной ДНК при заражении онкорнавирусами птиц чувствительных клеток в зависимости от множественности инфекции обнаруживается через 1 — 9 ч и продолжается до 48 ч, затем снижается. Интеграция начинается через 16 ч, а количество вирусной ДНК, ассоциированной с клеточной ДНК, возрастает до 72 ч после чего остается на достигнутом уровне.
Процесс синтеза вирусной ДНК и ее интеграция носят сходный характер как для AMV (продуктивная инфекция), так и для RSV (трансформация). Показано, что вирусная ДНК синтезируется в виде линейных молекул с массой ЗХ106 (что соответствует размеру одной субъединицы), которые затем ковалентно связываются с клеточной ДНК.
На 13-й час инфекции обнаруживается, например, от 3 до 10 дополнительных копий RAV2 на гаплоидный геном (в незараженных куриных клетках содержится 7 копий последовательностей, гомологичных части генома RAV2), т. е. количество хромосомной ДНК в 10 000 раз и более превышает количество вирусной ДНК.
Этот показатель не возрастает при увеличении множественности и остается постоянным до 20 ч, после чего наблюдается резкое возрастание количества вирусной ДНК в клетках. Между 20-м и 40-м часом в клетках накапливается до 100 копий на гаплоидный набор клеточной ДНК. Большинство этих вирусных ДНК находится в неинтегрированном состоянии и постепенно элиминируется в процессе пассирования до 1 — 3 дополнительных копий.
Причем эти оставшиеся копии стабильно интегрированы в клеточную ДНК (Khoury, Hanafusa, 1976). Представленные данные согласуются с предположением о том, что куриные клетки содержат ограниченное число мест интеграции для генома онкорнавирусов.
В утиных клетках (пермиссивная система), трансформированных В77 — RSV, в ядерной фракции содержатся 6 — 7 копий, а в цитоплазме — 10 копий вирусной ДНК. Varmus и соавт. (1976) инкубировали такие клетки с бромдезоксиуридином и в течение 24 ч экстрагировали ДНК из ядерной и цитоплазматической фракции, определяя ее плавучую плотность центрифугированием в градиенте CsCl.
Оказалось, что основная масса вирусной ДНК в цитоплазме (около 80%) содержит бромдезок-сиуридин в обеих нитях, т. е. синтезируется в течение 24 ч, часть ДНК обнаруживается и в зоне с промежуточной плотностью.
В противоположность этому ядерная вирусная ДНК коседиментирует с нереплицирующейся клеточной ДНК.
Полностью трансформированные клетки уток, а также утиные фибробласты через 20 — 72 ч после инфицирования RSV содержат как интегрированную, так и неинтегрированную вирусную ДНК.
Через 20 ч после заражения определяется более одной копии вирусной ДНК на клетку. В полностью трансформированных клетках находятся 4 — 8 копий на клетку.
«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко