При сравнении недефектного (nd)RSV (штамм Шмидта — Руппина SR) и RSV штамм N8 (неспособного синтезировать гликопротеид вирусной оболочки) установлено, что 7 — 8 олигонуклеотидов, выявляемых в nd — SR — RSV, но отсутствующих в N 8 — RSV, образуют общий сегмент, который включает около 2200 нуклеотидов. Этот сегмент расположен на расстоянии 2800 — 5000 нуклеотидов от поли-А-конца (Wang Lu-Hai et al., 1976). В nd — SR — RSV по сравнению с дефектным по трансформации (td) SR — RSV обнаружены два дополнительных олигонуклеотида, которые, по-видимому, представляют собой sarc-ген.
Этот фрагмент локализуется между поли-А и участком, отсутствующим в N 8 — RSV. Во всех исследованных штаммах RSV выявлен общий фрагмент — участок С, располагающийся непосредственно за поли-А и присутствующий как в РНК вируса дикого типа, так и td-мутанта.
Итак, с помощью указанного метода сегменты вирусной РНК химически идентифицируются по содержанию крупных олигонуклеотидов, устойчивых к РНКазе. Затем определяют локализацию полученных олигонуклеотидов относительно поли-А-конца, начиная с самого мелкого фрагмента, содержащего поли-А.
Полученный порядок расположения олигонуклеотидов характеризуется как олигонуклеотидная карта. Генетические функции олигонуклеотидов идентифицируют с помощью трех тестов.
- Олигонуклеотиды, присутствующие в недефектных вирионах, но отсутствующие в соответствующих делекционных мутантах, определены ответственными за экспрессию этой функции в вирионах дикого типа.
- Вирусные рекомбинанты содержат специфический набор олигонуклеотидов от родителей, и следовательно, генетические функции определенных олигонуклеотидов могут быть идентифицированы, если эти олигонуклеотиды сегрегируют с родительского маркера в рекомбинант.
- Определенные вирусные олигонуклеотиды обнаруживаются во всех онковирусах, и если их функции известны, то их можно локализовать на карте.
На основании имеющихся данных, частичную генетическую карту RSV, координированную в отношении нуклеотидов (в 10-2), можно представить следующим образом: на 3´-кояце 0 — 2, поли-А длиной 150 — 200 нуклеотидов; 2 — 6,5, участок С; 6,5 — 20, sarc-ген; 20 — 28, сегмент, присутствующий в nd — SR — RSV, N 8 — RSV и td — SR — RSV; 28 — 50, последовательности, специфичные для гена белков оболочки — гликопротеидов (env); 50 — 100, гены, кодирующие синтез внутренних структурных группоспецифических белков (gag) и полимеразы (pol). Располагаются они в следующем порядке: 5´-gag — pol — env — sarc — поли-А — 3´, на 5´-конце находится участок связывания с РНК-затравкой (Billeter et al., 1976; Wang Lu-Hai et al., 1976). Аналогичная последовательность генов имеет место и в РНК онкорнавирусов млекопитающих (Many, 1977).
Методом гибридизации 3Н-ДНК-продукта, синтезированного на РНК MuLV, и РНК из различных типов клеток установлено, что в геноме онкорнавирусов мышей С-типа имеется фрагмент, присутствующий во всех репликационно-дефектных вирусах (Parks et al., 1976).
Этот общий фрагмент, вероятно, тесно связан с трансформирующими функциями и составляет 15% генома MuLV. Эти данные позволяют предполагать, что рекомбинационный акт, приводящий к образованию трансформирующих вирусов, происходит на общем участке генома.
Используя гибридизацию полного 3Н-ДНК-транскрипта MuLV с РНК из различных клеток, Parks и соавт. (1976) получили меченые ДНК-копии, специфичные для определенных областей генома:
- gp70 еnυ-ген,
- общего фрагмента FT+ (онкогена) трансформирующих вирусов,
- gag-ген белков р30, р15, р12 и р10.
Таким образом, осуществлено картирование делеций, связанных с репликацией в геноме трансформирующих онкорнавирусов С-типа мышей.
«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко