Особенно большие трудности в проблеме оценки биологической активности ХС по физико-химическим характеристикам возникают в том случае, когда реализация биологической активности ХС — многоэтапный процесс. В качестве примера, иллюстрирующего трудности интерпретации физико-химических особенностей поведения молекулы для оценки ее активности, рассмотрим результаты изучения взаимодействия противоопухолевого антибиотика оливомицина и ДНК.
Эти результаты были получены путем комплексного применения высокочувствительных, и в то же время сравнительно простых и доступных люминесцентно-адсорбционных методов и кинетических подходов для изучения молекулярного механизма взаимодействия низкомолекулярного лиганда с мишенью. Этот цикл работ был выполнен нами (Г. М. Баренбойм, В. X. Брикенштейн и сотрудники).
Оливомицин — антибиотик группы аурелевой кислоты, формула которого приведена на рисунке ниже.
Структурные формулы оливомицина в формах А и В
Мишенью оливомицина в клетке является ДНК, действие оливомицина приводит к подавлению матричной активности ДНК в процессах ДНК-зависимого синтеза РНК и ДНК-зависимого синтеза ДНК. Оливомицин практически не взаимодействует ни с какими структурами, кроме хроматина, связывание с которым происходит в присутствии ионов магния.
На первом этапе этой работы исследовались спектральные свойства молекулы оливомицина в различных условиях (изменялись полярность растворителя, рН, ионная сила и т. д.).
Постановка подобных экспериментов является обязательным этапом, поскольку эти результаты необходимы для интерпретации спектральных изменений, наблюдаемых при связывании лиганда с биополимером. Было показано, что молекула оливомицина может находиться в двух таутомерных формах, равновесие между которыми смещается в зависимости от условий окружения. Для того чтобы выяснить, какой из этих форм отвечает молекула оливомицина при физиологических значениях рН, сравнивались экспериментально измеренные и расчетные спектры поглощения (смотрите рисунок ниже).
Спектр оптического поглощения оливина
Прямые вертикальные линии — расчетные электронные переходы в оливине (формы А и В) при поглощении света; сплошная кривая — экспериментальный спектр оливина при концентрации 2*10-5моль/л, pH 7,2. λ — длина волны в нм; f — сила осциллятора (для расчетного спектра), D — оптическая плотность.
Расчет был выполнен методом CNDO И. Л. Шамовским. Из рисунка видно, что длинноволновая полоса поглощения есть только у формы А, и таким образом была определена таутомерная форма, в которой молекула оливомицина существует при нейтральных pH.
Следует отметить, что ранее считалось, что в области нейтральных pH оливомицин существует в форме В. Приведенный пример лишний раз иллюстрирует важную роль квантовохимических расчетов и тесную связь различных подходов в исследованиях механизма взаимодействия низкомолекулярных лигандов с биополимерами.
На следующем этапе работы изучался механизм взаимодействия оливомицина с ионами Mg2+, поскольку ранее было показано, что он образует комплекс с этими ионами и эффективность взаимодействия с ДНК намного возрастает в присутствии Mg2+. В этих исследованиях использовались как стационарные измерения, так и изучение кинетики реакции методом «остановленной струи».
Была предложена следующая схема реакции:
[ОЛ] A+Mg2+↔[ОЛ Mg2+] IA [ОЛ Mg2+]IIA.
[ОЛ] B+Mg2+↔[ОЛ Mg2+]IВ [ОЛ Mg2+]IIВ.
Согласно этой схеме ионы магния образуют комплекс с обеими таутомерными формами молекулы оливомицина, причем константа связывания с формой В больше, чем с формой А. На I стадии реакции Mg2+ взаимодействует с хромофором (агликоном) оливомицина.
На II стадии происходит изменение конформации молекулы и ион металла, уже образовавший комплекс с хромофором, образует две дополнительные координационные связи с сахарными остатками.
В результате, как было показано с помощью измерений степени поляризации флуоресценции и характеристических времен ее затухания, эффективный гидродинамический объем молекулы оливомицина уменьшается примерно в 2,5 раза.
Таким образом, при образовании комплекса с ионами магния образуется компактная конфигурация молекулы оливомицина, и, кроме того, в такой конформации все атомы кислорода, кроме кислорода кетогруппы в боковой цепи хромофора, закрыты и экранировка отрицательных зарядов кислорода облегчает встраивание комплекса оливомицина с Mg2+ в малый желоб ДНК.
«Биологически активные вещества»,
Г.М.Баренбойм, А.Г.Маленков