Особое значение для оценки сдвигов, происходящих в энергетическом обмене на ранних этапах трансформации, детерминированной онковирусом, приобретает анализ структурной перестройки митохондрий, осуществляемый параллельно с определением функциональных изменений, полученных на этой же системе и в те же сроки с помощью биохимических методов.
Сведения о подобных исследованиях в литературе отсутствуют. А. И. Агеенко, А. С. Ягубов и Ю. Е. Виторган (1977) провели анализ тонкого строения митохондрий с помощью морфометрии, для которой отбирали по 30 клеток культуры ФЭК, инфицированных вирусом А12.
С фотоотпечатков (увеличение 27 000, электронный микроскоп JEM-7A) вычисляли следующие морфометрические параметры: поверхностно-объемное отношение митохондрий (SMV/VMV; объемную фракцию площади поверхности крист митохондрий (Skpv); коэффициент фрагментации крист — Кkpф, определяемый как NAP/LAP, где NAP —количество крист и LAP—протяженность крист на единице площади среза цитоплазмы; долю митохондрий со средними размерами — AM.
На основании первичных морфометрических параметров вычислялся коэффициент уровня морфологической организации митохондрий: Км = Skpv*SMV/VMV*1/Kkpф*АМ. Все полученные величины обрабатывали статистически. Доверительные интервалы средних связаны с надежностью 95%.
Оказалось, что показатель Skpv несколько уменьшен на 3-й и 18-й дни культивирования. Заражение культуры онкогенным аденовирусом 12-го типа человека приводило к снижению этого морфологического параметра на 24-й день исследования и некоторому увеличению на 3-й день.
Показатель SMV/VMV для клеток интактной культуры был несколько уменьшен в 1-й день культивирования и почти не изменялся в другие сроки. При заражении культуры вирусом обнаружено существенное понижение данного параметра на 3-й день и незначительное повышение на 24-й день исследования. КфР почти не изменялся на протяжении всех сроков культивирования. Не были выявлены изменения этого параметра и при заражении вирусом А12.
Итак, выявленные изменения морфометрических параметров, по-видимому, связаны с ростом культуры, а не с внедрением вируса А12 в клетку. При сравнении морфологических параметров тонкого строения митохондрий клеток ФЭК, культуры крысиной саркомы 321-КРС и культуры саркомы А12 хомяка оказалось, что из всех изученных показателей изменялась только площадь поверхности крист митохондрий.
Наибольшие величины данного параметра были зафиксированы в культуре клеток саркомы А12.
Мы также сравнили морфологические параметры тонкого строения митохондрий в клетках ФЭК и крысиной саркомы 321-КРС в системе in vivo, а также в клетках саркомы А12 хомяка в системе in vivo.
Оказалось, что поверхностно-объемное отношение митохондрий и коэффициент фрагментации крист митохондрий в исследуемых объектах существенно не изменились.
Площадь поверхности крист митохондрий в клетках 321-КРС была выше, чем в других исследованных системах.
При сравнении изученных нормальных и опухолевых тканей in vivo и в культуре выявлены значительные различия, касающиеся таких морфометрических характеристик, как площадь поверхности крист и поверхностно-объемное отношение митохондрий. В частности, Skpv в клетках культуры нормальных и опухолевых тканей была достоверно и значительно выше таковой в соответствующих тканях in vivo. В культурах опухолевых тканей также отмечалось достоверное повышение поверхностно-объемного отношения, которое не имело статистически достоверных различий для нормальных клеток ФЭК и исследуемых сарком в культуре и in vivo. Уровень фрагментации крист для всех исследуемых групп был статистически одинаков.
Таким образом, в культурах тканей митохондрии как опухолевых, так и нормальных клеток были более вы-соко развиты по сравнению с митохондриями клеток in vivo преимущественно за счет значительного увеличения показателей Skpv и SMV/VMV.
Наконец, сравнение кинетики изменений ЛДГ и МДГ в клетках культуры ФЭК при их трансформации вирусом А12 с данными количественного анализа тонкого строения митохондриального аппарата этих клеток показало, что биохимические сдвиги наступают гораздо раньше, практически с момента инфицирования, в то время как на ранних сроках изменения в структуре митохондрий не определяются даже с помощью количественных методов.
Следовательно, для выявления специфики изменений в энергетическом обмене клетки на ранних стадиях вирусного канцерогенеза наиболее приемлемы методы, позволяющие изучать кинетику общей активности и перераспределения изоформ ключевых ферментов энергообмена клетки.
«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко