Паповавирусы
За последние годы разработаны следующие методики исследования молекулярно-генетической структуры генома SV40:
- анализ функций фрагментов ДНК SV40 различной длины, интегрированных в определенные участки некоторых аденовирусных генов (недефектные гибриды Ad2+XSV40); эта система рассматривается как модель взаимодействия SV40 с ДНК клетки-хозяина,
- специфические разрывы молекул ДНК SV40 с помощью ограничивающих бактериальных эндонуклеаз (рестриктаз).
Кроме того, наличие асимметрического неодновременного синтеза РНК на матрице интегрированной в клеточный геном ДНК паповавирусов позволяет также картировать геномы этих вирусов, так как в настоящее время известно, какие белки являются продуктами ранних и поздних генов.
Каждый недефектный гибрид (ND) SV40 — Ad2+ND1-5 содержит один сегмент (различной длины) ДНК SV40, ковалентно встроенный в специфический локус генома Ad2.
Гибридные вирусы обязательно содержат концевые районы раннего гена SV40, продукт которого необходим для размножения аденовирусов в обезьяньих клетках (Sambrook, 1977). Экспрессия раннего гена поставлена под контроль аденовируса, при этом синтезируется гибридная РНК, на которой синтезируются гибридные белки.
Транскрипция гибридных молекул осуществляется подобно транскрипции фрагмента или всего вирусного генома, интегрированного в ДНК клетки. РНК-полимераза аденовируса синтезирует часть мРНК, а затем непрерывно присоединяет к ней перекрывающиеся последовательности РНК, закодированные на встроенном сегменте ДНК SV40, пропорционально его величине.
Направление копирования гена SV40 в гибриде то же самое, что и в геноме исходного вируса SV40. Следовательно, недефектные гибриды Ad2+ND1-5 могут синтезировать как ранние белки, специфичные для вируса SV40, т. е. Т- и TSTA-антигены, так и термостабильные новые U-антигены.
Для анализа генома SV40 применили несколько ограничивающих эндонуклеаз из различных бактерий, которые разделяются на два класса: не обладающие специфичностью разрыва (например, рестриктаза из штамма Е. coli В) и обладающие специфичностью (рестриктазы из Е. coli RI и RII, H. influenzae, H. parainfluenzae).
Все рестриктазы переводят замкнутую циркулярную ДНК SV40 в линейную форму, при этом рестриктаза из Н. inlfuenzae вызывает образование И фрагментов, а из Н. parainfluenzae 4 фрагментов.
Для составления карты генома с помощью этих фрагментов использовали следующие подходы: полное переваривание отдельных фрагментов с последующим анализом перекрывающихся участков и последовательное переваривание рестриктазами из Н. influenzae и Н. parainfluenzae.
За точку отсчета (нулевую точку) принят одиночный разрыв в специфичном участке ДНК SV40, продуцируемый рестриктазой Е. coli RI. Для определения точек инициации и терминации репликации использовали импульсную метку по 3Н-тимидину с.последующим определением последовательности синтеза различных сегментов молекулы.
«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко