Содержание вирусспецифической нити РНК, комплементарной геномной РНК (негативная), в клетках находится на очень низком уровне. Stavnerer и соавт. (1976) предложили метод их выделения.
В качестве модели использовали RSV штамм В77 и MTV.
Негативная РНК обнаружена в ядре и цитоплазме инфицированных клеток, а также в составе популяции РНК вирионов В77.
Эта РНК из ядер гибридизировалась с 30% генома В77 и 45% генома MTV, в то время как негативная РНК из цитоплазмы в обоих случаях гибридизировалась с 20% вирусного генома, а в составе вириона В77 — с 15% генома этого вируса. Подсчитано, что плюс-нити РНК составляют 0,3 — 0,5% в ядерной РНК и 0,1 — 0,3% в цитоплазменной РНК, а уровень негативной РНК 0,005% и 0,0005% соответственно.
Клетки, зараженные вирусами саркомно-лейкозного комплекса мышей, содержат два типа вирусспецифических мРНК, седиментирующих в градиенте сахарозы в зонах 35S и 20S (иногда, за редким исключением, минорные пики выявлялись в зонах 14S и 26 — 28S).
В трансформированных же вирогенных клетках неприродного хозяина, не продуцирующих вирус, определялись только вирусные 33S мРНК. Конкурентная гибридизация показала, что 35S РНК из клеток полностью гомологична 35S-субъединицам вирионной РНК, в то время как 33S РНК из вирогенных клеток, в которых находился полный вирусный геном, содержала только часть последовательностей вирионной 70S РНК.
Все типы вирусной РНК обнаружены и в полисомах инфицированных клеток, т. е. вполне вероятно, что эти РНК транслируют синтез определенных вирусспецифических белков, не все из которых, очевидно, в настоящее время еще идентифицированы. 20S РНК не является продуктом деградации 35S РНК, а представляет собой самостоятельный тип РНК, обеспечивающий важные этапы в репродукции вирионов — синтез белков оболочки (этот тип РНК определяется только в вируспродуцирующих клетках).
Установлено, что приблизительно 1 % РНК в вируспродуцирующих клетках является вирусспецифической и около 1/3 этих вирусных последовательностей ассоциировано с ядерной фракцией (Haseltine Baltimore, 1976).
Для определения размеров такой РНК тотальный препарат ядерной РНК подвергали фракционированию в градиенте сахарозы, а затем отдельные фракции гибридизации с 3Н-ДНК-продуктом MuLV.
При центрифугировании в неденатурирующих условиях вирусная ядерная РНК седиментирует весьма гетерогенно в зоне от 10S до 100S. Это распределение отличалось от распределения цитоплазматической РНК, при котором основная масса молекул была представлена 35S-PHK.
После денатурации (т. е. после центрифугирования в градиенте сахарозы с диметилсульфоксидом) ядерная вирусная РНК представлена в основном 35S-компонентом со значительным количеством низкомолекулярных РНК.
Небольшая фракция (2 — 5%) ядерной РНК седиментирует быстрее, чем 35S-PHK после денатурации. Эти быстро седиментирующие вирусные РНК, вероятно, представляют собой неполный предшественник 35S-PHK.
«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко