На основании имеющегося экспериментального материала была предложена следующая модель синтеза ДНК. Начальный этап ДНК происходит в репликационном комплексе, содержащем молекулы ДНК, связанные водородными связями с молекулами вирусной РНК.
Каждая молекула ДНК вытесняется как однонитевая молекула (минус-нить) в результате синтеза последующей минус-нити ДНК.
Синтез двуспиральной ДНК следует за синтезом односпиральной ДНК, которая является матрицей для синтеза двуспиральной ДНК. Односпиральная ДНК дуплицируется (до или после того, как она сойдет с РНК-матрицы) и образует двунитевую молекулу ДНК.
Основное количество вирусной ДНК 95% синтезируется в течение 1-го часа инфекции. Для ее образования не требуется синтеза клеточных ферментов de novo. Наибольшей матричной активностью обладает 70S РНК, хотя 4S, 5S и 7S РНК также транскрибируются в полимеразной реакции.
Судьба родительских РНК, точно так же как и функция РНКазы Н в этом процессе, до сих пор неизвестна. Можно только предполагать, что РНКаза Н после синтеза ДНК — РНК-гибрида переваривает РНК-матрицу, что является необходимым условием для последующего синтеза двуспиральной ДНК.
Принципиально важным является вопрос о том, считывается ли весь геном вирусной РНК in vitro при синтезе двуспиральной вирусспецифической ДНК или при этом транскрипция идет лишь с определенного участка вирусного генома. Вначале методом реассоциации было показано, что двуспиральная ДНК, синтезированная на матрице 70S РНК вируса саркомы Рауса, состоит из двух типов молекул, одни из которых содержат 5% последовательностей вирусного генома и транскрибируются главным образом с определенных участков РНК (быстро реассоциирующиеся молекулы), другие — 30% (и более) генома (медленно реассоциирующиеся молекулы).
Эти факты сразу же поставили под сомнение возможность использования 3Н-ДНК-продукта для выявления вирусспецифических нуклеотидных последовательностей в клетках. Однако вскоре выход был найден благодаря использованию актиномицина D, который, как известно, не влияет на синтез ДНК на РНК-матрице, но блокирует второй этап реакции — синтез двуспиральной ДНК.
Следовательно, в системе с актиномицином D синтезируются только односпиральные минус-нити вирусной ДНК, которые, как оказалось, содержат все последовательности нуклеотидов, входящие в вирусный геном. Например, подобраны условия, позволяющие осуществлять полную транскрипцию РНК RSV с помощью обратной транскриптазы AMV (Darlix et al., 1977).
Анализ процесса свидетельствует о том, что инициация синтеза ДНК in vitro с помощью полимеразы AMV происходит на 3 — 4 участках РНК RSV.
В опытах по гибридизации вирусной 70S РНК с ДНК, синтезированной в отсутствие актиномицина D, показано, что, хотя все последовательности вирусного генома транскрибируются в полимеразной реакции, количество копий, получаемых с разных участков генома, различно.
Таким образом, вирусные ДНК-копии могут содержать информацию практически всего вирусного генома.
«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко