Как отмечалось выше, каждая субъединица 30 — 40S РНК имеет одинаковые концевые последовательности и примерно одинаковые размеры. Естественно, возникает вопрос о генетической идентичности или различии этих субъединиц.
В первом случае геном онкорнавируса будет сегментарно-полиплоидным, а во втором — сегментарно-гаплоидным, т. е. каждая субъединица такого генома будет нести собственную генетическую информацию. Для определения последовательности нуклеотидов, или «композиционной сложности» (sequence complexity), в субъединицах 30 — 40S РНК используют несколько подходов.
В первую очередь заслуживает внимания метод, основанный на определении кинетики ренатурации меченой вируоспецифической ДНК, синтезированной с избытком вирусной РНК in vitro с помощью обратной транскриптазы. Кинетика образования двунитевых комплексов в этом случае зависит от длины и состава субъединиц РНК и может иметь разный характер.
Второй метод основан на измерении молярного количества олигонуклеотидов, образующихся при гидролизе РНКазой Т1 высокомолекулярной вирусной РНК. Причем в некоторых случаях полученные олигонуклеотиды анализируют методом фингерпринта.
На основании многочисленных экспериментов, проведенных в этом направлении, а также учитывая исследования биологии онкорнавирусов, по-видимому, предпочтение следует отдать полиплоидной модели генома.
Этот вывод в равной мере относится как к геному вирусов С-типа, так и к геному вирионов В-типа (Friedrich et al., 1976). Генетическими методами также доказано существование полиплоидных геномов онкорнавирусов (МсСаter, 1977). Вместе с тем установлено, что сегменты 30 — 40S РНК с идентичной композиционной сложностью не являются пермутантными и характеризуются уникальным распределением олигонуклеотидов во всех субъединицах.
После обработки 35S РНК-субъединиц разных онкорнавирусов РНКазой Т1 и последующего двумерного электрофореза в полиакриламидном геле обнаруживается 11 — 29 крупных олигонуклеотидов, которые локализуются в определенных участках по отношению к поли-А-фрагменту на 3´-конце молекулы (Billeter et al., 1976).
Для определения биологических функций Billeter и соавт. (1976) использовали 5 рекомбинантов между PR — RSV — В и нетрансформирующим вирусом из субгруппы А — RAVI, которые селекционировали по способности трансформировать клетки (свойство PR — RSV — В) и расти на куриных клетках фенотипа С/В (свойство RAVI). РНК всех рекомбинантов анализировали с помощью метода фингерпринта.
Оказалось, что все они содержат участок, специфичный для PR — RSV — В, около поли-А. Следовательно, онкоген, несущий информацию, необходимую для трансформации фибробластов, расположен на 3´-конце молекулы.
С другой стороны, все рекомбинанты, потерявшие PR — RSV — В-специфичный фрагмент в середине генома, одновременно приобретают RAVI специфические последовательности, обусловливающие способность расти и репродуцироваться на клетках С/В (последовательности, кодирующие синтез белков оболочки — env-функции).
«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко