Равновесные концентрации ДСМ и АНС в митохондриях клетки существенно зависят от величины суммы потенциалов на плазматической и митохондриальных мембранах (ϕ1+ ϕ2). Чтобы по флоуресценции ДСМ в митохондриях отдельных клеток однозначно судить, на какой именно мембране (на внешней или на митохондриальной) изменилась трансмембранная разность потенциалов, предлагается использовать две схемы инкубации клеток с флуоресцентным зондом и ксенобиотиком:
- клетки + ксенобиотик (инкубация 15 мин) + ДСМ (или АНС);
- клетки + ДСМ (инкубация 15-мин) + ксенобиотик.
Первая схема позволяет зарегистрировать ответ зондов в отдельных клетках или в суспензии клеток, обусловленный изменением в целом суммы (ϕ1+ ϕ2). Вторая схема позволяет выявить снижение потенциала на мембранах митохондрий (Δϕ2) по выходу катионов ДСМ в цитоплазму и аккумуляции их в ядре. Рассмотрим примеры таких экспериментов на тест-объектах — одноклеточных организмах (тетрахимена) и лимфоцитах.
Тетрахимена (Tetrahymena pyriformis) является чрезвычайно удобным объектом для обнаружения влияния ксенобиотиков на митохондрии, поскольку в ней содержится их более 800 штук, расположенных в определенном геометрическом порядке (по «меридианам»). По флуоресцентной картине ДСМ в тетрахимене можно следить за изменением не только энергетического состояния митохондрий, но и их размеров и расположения в клетке (смотрите рисунок ниже).
Флуоресценция ДСМ в клетке Tetrahymena Pyriformis
а — концентрация ДСМ— 20 мкМ. Видны участки, богатые энергезированными митохондриями; б — предварительная инкубация с димедролом (0,5 мМ); концентрация ДСМ 20 мкМ. Об. 90, фотоокуляр (Гомал 3). Видны «набухшие» митохондрии (вследствие накопления в них катионов ДСМ и димедрола).
Благодаря полихроматической флуоресценции ДСМ можно визуально обнаружить снижение суммарного потенциала (ϕ1+ϕ2) в тетрахимене по изменению флуоресценции в митохондриях от ярко-желтой до зеленой. При сопоставлении влияния ксенобиотиков на характер движения клеток и на флуоресцентную картину можно установить, в каких случаях деэнергизация митохондрий коррелирует с изменениями в структуре мембран.
В таблице ниже суммированы эффекты ксенобиотиков, полученные на тест-системе тетрахимена — ДСМ.
Качественная оценка эффектов действия заряженных ксенобиотиков на тетрахимену
| Ксенобиотик | Концентрация мМ | Характеристики митохондрий | Движение клеток | |
| Флуоресценция ДСМ относительно контроля, % | Морфологические изменения | |||
| Аминазин | 0,5 | 5—10 | Набухание, разрушение | Остановка |
| Димедрол | 0,5 | 40—60 | Набухание, разупорядочение | Вращение |
| 2,4-динитрофенол (ДНФ) | 0,1 | 20—50 | Сжатие, разупорядочение | Замедление |
| Крезацин | 1,0 | 100 | Не влияет | Не влияет |
| Цианид | 5,0 | 30—50 | Сжатие, разупорядочение | Замедление, остановка |
«Биологически активные вещества»,
Г.М.Баренбойм, А.Г.Маленков