Следующий уровень сложности модели — митохондрии в составе живой клетки. Тестирование состояния митохондрий в клетке может производиться методами флуоресцентного анализа, технологически хорошо совместимого с автоматизированной системой классификации. Митохондрии обладают собственной флуоресценцией, обусловленной остатками ароматических аминокислот в составе белков митохондрий, а также флавиновыми и пиридиновыми компонентами в их дыхательной цепи (Barenboim et al., 1969; Черногрядская и др., 1978). Для оценки функционального состояния митохондрий оказалось также очень полезным использовать флуоресцентные зонды — ХС, флуоресценция которых зависит от состояния митохондрий, с которыми они связываются слабыми невалентными взаимодействиями.
Тестовая система клетка — митохондриальный флуоресцентный зонд была разработана Г. И. Морозовой под руководством Г. Е. Добрецова и Г. М. Баренбойма и описана в ряде публикаций (Морозова и др., 1982а, б; Морозова, 1984). В основе этой тест-системы лежит использование двух флуоресцентных зондов: широко известного 1,8-анилинонафталинсульфоната (АНС) и оригинального зонда n-толуолсульфоната 4-(n-диметиламиностирил)-1-метилпиридиния (ДСМ). Структуры этих зондов и некоторых ксенобиотиков, упоминаемых в этом разделе, изображены на рис. Сродство этих зондов к определенным структурам определяется их амфифильностью (способностью распределяться между водной и мембранной фазами в измеряемой пропорции) и зарядом. Оба этих зонда образуют как бы анионно-катионную пару, что обеспечивает их высокую совокупную чувствительность к изменению зарядов определенных субклеточных структур, а также позволяет различать изменение электрических характеристик клеточных мембран и изменения конформации самих мембран между цитоплазматической и митохондриальной мембранами (Морозова, 1984). Спектры флуоресценции зондов АНС и ДСМ показаны на рисунке ниже.
Структурные формулы зондов АНС, ДМС и некоторых заряженных ксенобиотиков
Весьма существенным для данного метода является полихроматичность флуоресценции зонда ДСМ в живых клетках: в мембранах — свечение зеленое, в цитозоле — слабокрасное, в ядре — красное, в митохондриях, имеющих потенциал на мембране,— ярко-оранжевое (ярко-желтое), а в отсутствии потенциала — зеленое.
Нормированные спектры флуоресценции ДСМ (а) и АНС (б) в суспензии лимфоцитов (1) и в воде (2)
Fmах — интенсивность флуоресценции (F) в максимуме спектра; возбуждение флуоресценции ДСМ и АНС при 450 и 370 нм соответственно. Концентрация ДСМ — 10 мкМ, АНС — 40 мкМ; концентрация клеток 2*106мл-1. Зонд АНС в воде люминесцирует с очень низким квантовым выходом.
В соответствии с хемоосмотической концепцией П. Митчелла синтез АТФ из АДФ и фосфата в митохондриях аэробных клеток и в мембранах аэробных бактерий зависит от наличия на этих мембранах трансмембранной разности потенциалов. Известно, что проникающие ионы и заряженные красители распределяются по обе стороны модельных или биологических мембран в соответствии с величиной этой разности потенциалов на мембранах. Снижение ее в митохондриях клеток, вызванное какими-либо изменениями в их функциональном состоянии, например экзогенными факторами, приводит к перераспределению заряженных красителей между органеллами и средой. Такая же закономерность была обнаружена для заряженных зондов ДСМ и АНС. Эксперимент показал, что катионный зонд ДСМ интенсивно флуоресцирует в митохондриях аэробных клеток, в то время как анионный зонд АНС дает очень слабую флуоресценцию в них. Характер флуоресценции этих зондов в живых клетках резко меняется при изменении энергетического состояния митохондрий.
«Биологически активные вещества»,
Г.М.Баренбойм, А.Г.Маленков