Для определения содержания антибиотика в жидкостях организма (кровь, экссудаты полостей, ликвор и др.) можно использовать также метод последовательных разведений в жидкой среде.
Питательной средой в этом случае служит среда Гисса с глюкозой и реактивом Андреде (рН 7,2) или фенол-сывороточная среда (2 мл 10% раствора глюкозы, 2 мл сыворотки крови человека, 6 мл дистиллированной воды и 0,25 мл насыщенного раствора фенолрота).
Среды заражают стандартизованной взвесью определенного для каждого антибиотика тест-микроба из расчета 1000—10 000 микробных клеток на 1 мл среды. Зараженную среду разливают по 0,2 или 0,5 мл в стерильные пробирки. Для каждого образца готовят два ряда по 10 пробирок в каждом. Первый ряд служит для разведения раствора стандарта антибиотика (стандарт разводят до нужной концентрации сывороткой человека или здорового животного), второй — для разведения испытуемого материала (например, сыворотки). Разведения (двукратные, последовательные) испытуемого раствора и стандартного образца производят в объеме 0,2 или 0,5 мл засеянной среды.
Контролями опыта служат незараженная (контроль прозрачности и стерильности) и зараженная соответствующим тест-микробом (контроль роста культуры) среды. Результаты учитывают после 16—18 ч инкубации при 37° по изменению цвета (среда Гисса становится розовой, фенол-сывороточная — из красной при рН 7,2 становится желтой за счет сбраживания растущими микроорганизмами глюкозы и изменения рН) и помутнению среды.
Для того чтобы установить концентрацию антибиотиков в исследуемой сыворотке, умножают наибольшее разведение сыворотки, задерживающее рост тест-микроба (разведение в последней пробирке с прозрачной, не изменившей цвета средой), на наименьшую концентрацию стандарта антибиотика в пробирке с отсутствием роста. Полученная величина соответствует содержанию антибиотика в 1 мл исследуемой сыворотки.
В приведенном в таблице ниже примере раствор стандарта пенициллина задерживает рост тест-микроба в концентрации 0,025 ЕД/мл, а испытуемая сыворотка — в разведении 1 : 8. Содержание пенициллина в не- разведенной сыворотке соответствует 0,025X8 = 0,2 ЕД/мл.
Определение содержания пенициллина в сыворотке
| Разведение сыворотки | 1:2 | 1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:32 | 1:64 |
| Рост тест-микроба | — | — | — | + | + | + |
| Концентрация стандарта пенициллина в среде в 1 ЕД/мл | 0,2 | 0,1 | 0,05 | 0,025 | 0,0125 | 0,0063 |
| Рост тест-микроба | — | — | — | — | + | + |
Условные обозначения: ( + )-рост тест-микроба, (—)-отсутствие роста.
Кроме определения концентрации антибиотика в тканях и жидкостях организма, описанные микробиологические методы используют для определения активности образцов на всех стадиях производства антибиотиков — от исследования культуральной жидкости до готовой продукции, для определения стабильности антибиотиков или препаратов, содержащих антибиотики. Химические и физико-химические методы исследования количественного содержания антибиотика в препарате применяют в том случае, если получаемые результаты совпадают с результатами микробиологической оценки активности.
«Справочник по антибиотикам», С.М.Навашин, И.П.Фомина