Определение концентрации антибиотиков в биологических субстратах или активности препаратов антибиотиков можно проводить на двух или одном слое питательной среды, разлитой в чашки Петри. Для нижнего слоя используют «голодные» незасеянные среды, для верхнего или одного слоя агаровую среду засевают соответствующим тест-микробом. Обычно используют питательные среды, приготовленные на бульоне Хоттингера. Каждому антибиотику соответствует среда с определенным содержанием аминного азота (смотрите таблицу ниже).
Среду, предназначенную для нижнего слоя, разливают в чашки Петри одинакового диаметра с ровным и плоским дном, установленные на горизонтальной поверхности, отрегулированной по ватерпасу. Нижний слой можно разливать заранее, сохраняя чашки при температуре 2—8° в течение 3—5 сут. Питательную среду для верхнего слоя заражают взвесью соответствующего тест-микроба (смотрите таблицу ниже).
Аспорогенные культуры вносят в среду при температуре не выше 48—50°, взвесь спор — при 65—70°. Наиболее удобны для определения активности антибиотиков спорообразующие микроорганизмы. Споры могут длительно сохраняться без изменения свойств (взвеси спор Вас. mycoides и Вас. subti1is в дистиллированной воде сохраняются до 5 лет). О способах выращивания и сохранения тест-культур см. в Государственной фармакопее СССР (изд. X).
Посевная доза тест-микроба должна быть предварительно установлена для каждой серии среды в пределах цифр, указанных в таблице ниже.
Смотрите таблицу — Питательные среды и тест-культуры, применяемые при определении активности антибиотиков методом диффузии в агар
Увеличение плотности посева может сопровождаться образованием густого микробного «газона» и уменьшением размеров зон задержки роста тест-микроба. При засеве недостаточным количеством микробных клеток на поверхности среды не образуется сплошного роста, зоны не имеют четко очерченного края и не могут быть точно измерены.
Приготовление рабочих растворов стандарта антибиотика и испытуемого материала
Для приготовления растворов стандарта антибиотика делают произвольную, но точную, навеску на аналитических весах. Навеску растворяют в соответствующем растворителе (смотрите таблицу ниже) из расчета 1 мг в 1 мл или 1000 ЕД в 1 мл (основной раствор).
Смотрите таблицу — Растворы, применяемые для разведения стандартов и испытуемых образцов, условия приготовления и хранения растворов
Дальнейшие разведения готовят путем разведения основных растворов до нужных концентраций.
Для улучшения условий диффузии антибиотиков в агар для разведения используют буферные растворы с определенным солевым составом и значением рН.
«Справочник по антибиотикам», С.М.Навашин, И.П.Фомина