Методика определения ЛДГ
После окончания электрофореза пластинки перекладывают в специальную камеру для окраски, заливают красящую смесь и инкубируют в термостате 2 ч при 37 °С. Затем сливают смесь и несколько раз тщательно промывают агаровые пластинки дистиллированной водой.
Сушку пластинок производят следующим образом: вырезанные по форме пластинки полоски хроматографической бумаги осторожно накладывают на агар, не сдвигая его. На чистую фильтровальную бумагу кладут пластинки хроматографической бумагой вниз и оставляют сохнуть до следующего дня. Затем хроматографическую бумагу открепляют, осторожно протирают стекло и производят количественное определение изоферментов, фотоэлектроколориметрическим методом, разработанным Ю. А. Юрковым (1968).
Для электрофореза используют концентрированную мочу, предварительно диализированную. Очень удобен и прост метод концентрирования мочи в целлофановых мешочках под вентилятором, предложенный Ю. А. Юрковым (1967). После того как в мешочке останется 0,1 мл мочи, последнюю собирают микропипеткой в узкодонную центрифужную пробирку, где она сохраняется до проведения электрофореза (хранить следует в холодильнике при температуре 4 °С не более 2 сут, после чего активность катодных фракций практически теряется).
В норме общая активность ЛДГ в моче здоровых детей от 3 до 14 лет колеблется от 2 до 18 единиц [Wroblevski W., 1961], составляя в среднем 9,76 ±0,72. Спектр изоaферментов здоровых детей характеризуется наличием в моче ЛДГ-1 и ЛДГ-2 с преобладанием ЛДГ-1.
При пиелонефрите, независимо от его формы, при обострении процесса в моче у большинства детей спектр изоферментов характеризуется появлением катодных фракций (от 3 до 5 фракций). При этом определяется зависимость спектра от формы пиелонефрита, длительности заболевания и степени распространенности процесса в почках.
Так, у детей с выраженной клинической картиной необструктивного пиелонефрита при давности заболевания до 3 лет отмечается увеличение активности катодных фракций, причем более значительное при двустороннем процессе.
Самые резкие изменения обнаруживаются у больных с обструктивными формами пиелонефрита: у всех детей в моче определяется 5 фракций, причем преобладает активность катодных фракций. Преимущественное содержание анодных фракций (ЛДГ-1 и ЛДГ-2) при наличии всех 5 фракций и незначительная активность характерны. Для детей с наименьшей степенью поражения почек [Пугачева В. И., 1972].
«Детская урология», Н.А. Лопаткин
Для количественного определения изоферментов ЛДГ существует ряд методов, основанных на различии в апоферменте изозимов. Применяют методы электрофореза, хроматографии, термической инактивности и др. В клинике наиболее широко используется метод зонального электрофореза на агаровом геле с окрашиванием тетрахолиевыми солями, адсорбция на ДЗАЕ-целлюлозе и термическое инактивирование. Наиболее точны и надежны методы, основанные на электрофоретическом разделении изоферментов [Юрков Ю….
Общая активность ЛДГ в моче больных пиелонефритом в среднем достигает 37,5 ± 3,5 единицы Вроб-левского, но какой-либо зависимости ее от формы и степени тяжести пиелонефрита не отмечено. Перспективными для изучения при воспалительных заболеваниях почек являются ферменты малатдегидрогеназа (МДГ) и альдолаза (АЛД). МДГ относится к ферментам цикла Кребса, который катализирует обратимую реакцию окисления яблочной кислоты в…
Исследуемые сыворотки разводят 1:10 с помощью кроличьей сыворотки (в разведении 1:250), подогревают в электрической водяной бане при 54 °С в течение 20 мин (для разрушения комплемента) и охлаждают. Затем к ним добавляют формалинизированные или свежие эритроциты барана из расчета 0,2 мл на 1 мл сыворотки, содержимое пробирки встряхивают и помещают на 30 мин в термостат…
Приготовленные Аг разводят определенным количеством буфера (рН 6,4) и соединяют с раствором формалинизированных и танизированных эритроцитов в таком количестве, чтобы окончательное разведение Аг было 1:10. Установлено, что именно это разведение является оптимальным, так как не дает гемолиза или агглютинации эритроцитов в отсутствие специфической сыворотки. Содержимое колбочек встряхивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 1…
Свежевыпущенную мочу центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин, отсасывают надосадочную жидкость и осадок дважды промывают в изотоническом растворе хлорида натрия с фосфатным буфером (рН 7,3). В отмытый осадок добавляют 0,2 мл разведенной 1:5 люминесцирующей кроличьей сыворотки против глобулинов человека. Осадок мочи вместе с сывороткой инкубируют при 37 °С в течение 30 мин, после…
