24 июля 2012

Метод искусственных гетерокарионов

Метод искусственных гетерокарионов оказался весьма эффективен для многих тест-систем клеток, трансформированных как РНК-, так и ДНК-содержащими онковирусами.

В некоторых случаях индикаторные культуры использовали даже для титрования освобожденного вируса по фокусам трансформации, которые он индуцировал (Svoboda et al., 1975).

Во всех этих экс-периментах чем больше был процент гетерокарионов, тем выше оказалась эффективность метода. Однако в системах, в которых использовали невирогенные опухолевые клетки, количество гетерокарионов, продуцировавших инфекционный вирус, редко превышало 1%. В отношении же вирогенных опухолей оно иногда равнялось 100%.

Иногда единственным и весьма эффективным путем «спасения» вируса (например, RSV из клеток млекопитающих) было слияние этих клеток под действием инактивированного вируса Сендай с клетками кур, предварительно зараженными вирусами-помощниками RAVI или RAV49 (Svoboda et al., 1977).

При таком хелпер-зависимом «спасении» RSV освобожденный вирус обладал специфичностью не вируса-помощника, а исходного RSV. «Спасенный» вирус давал одноударную кривую титрования на утиных эмбриональных фибробластах, т. е. он не являлся дефектным для инфекции и трансформации этих клеток.

Данные по активации эндогенных вирусов из нормальных клеток представлены в соответствующей главе. Отметим, только, что эндогенные вирусы, так же как и экзогенные вирусы лейкозов, могут выполнять функции вирусов-помощников при «спасении» MSV из безвирусных гомологичных и гетерологичных клеток, трансформированных этим вирусом.

По-видимому, в клетках, трансформированных ДНК-содержащими онковирусами (особенно имеющими крупный геном), в хромосомальную ДНК чаще встраивается только часть вирусных генов, ответственных главным образом за трансформацию.

Поэтому часто индукция полного инфекционного вируса из таких клеток, осуществляемая с помощью различных методик, не приводит к желаемым результатам. Например, подсчитано, что в разных линиях клеток, трансформированных вирусом А2, содержится более 16% фрагментов генома вируса А2, локализованных в левой части молекулы, причем отмечены незначительные отличия в присутствии одних и тех же рестриктазных фрагментов (от 2,9 до 6,9 копий для Е-фрагментов Hpal).

В клетках хомяка, трансформированных вирусом А5, как и при трансформации вирусом А2, отсутствует полный вирусный геном и выявлены только те фрагменты вирусного генома, которые также локализованы в левой части молекулы. В сумме в таких клетках выявляется от 35 до 40% генома вируса А5 (Botchan et al., 1975).

Аналогичные результаты получены и в отношении аденовируса 12-го типа.

Оказалось, что и в фибробластах эмбриона хомяка, трансформированных паповавирусом RF человека, с клеточным геномом интегрировано только 40% ДНК вируса (Miao, Dougherty, 1977). Вместе с тем некоторые линии клеток, трансформированных вирусом А12, и клетки опухолей, индуцированных путем заражения новорожденных хомяков аденовирусом человека 12-го типа, содержали множественные копии от 77 до 100% вирусного генома, которые были интегрированы в клеточную ДНК (Green et al.f 1977; Yano et al., 1977).

«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Установлена прямая пропорциональность между дозой различных агентов (митомицин С, бромдезоксиуридин, УФ- и 60Со-γ-облучение) и урожаем вируса, освобожденного из трансформированных клеток (Kaplan et al., 1975). Урожай вируса увеличивается по сравнению с контролем в 1000 — 10 000 раз. В линиях — продуцентах инфекционного SV40 доля индуцированных клеток составляла 2 — 6% (по данным определения продукции V-антигена…

В экспериментах, проведенных А. И. Агеенко и соавт. (1975), из перевивных сарком (с 50-й по 60-ю генерацию), индуцированных у хомяков аденовирусом 12-го типа, полный инфекционный вирус выделялся постоянно. Обнаружено, что при заражении центрифугатами разрушенных клеток перевивных сарком культуры почки эмбриона человека (ПЭЧ) в среднем через 5 дней отмечалось начало цитогенного действия вируса. Из первичноиндуцированных сарком…

Клетки, трансформированные всеми исследованными в настоящее время онкогенными ДНК-содержащими вирусами, в основном являются непермиссивными для полного репродуктивного цикла трансформирующего их вируса, и поэтому естественно, что полный инфекционный вирус ими не продуцируется. Как известно, существуют два крайних ответа пермиссивных клеток природного хозяина при взаимодействии с геномом ДНК-содержащих онковирусов — лизис и трансформация. Трансформация осуществляется тогда, когда…

Итак, по характеру взаимоотношений онковируса с трансформированной клеткой можно выделить следующие типы опухолевых клеток. Вируспродуцирующие клетки. Как правило, это относится к РНК-содержащим вирусам. Вирогенные клетки, в которых удается активировать вирусный геном с помощью различных методических приемов (трансплантации их естественным хозяевам онковируса или при использовании «контактной индукции», т. е. прямого контакта опухолевой клетки с чувствительной «индикаторной»…

Изучение посттранскрипционных превращений вирусных мРНК в клетках разных линий, трансформированных SV40, показало, что в тотальном препарате РНК содержатся молекулы, комплементарные ранней нити ДНК SV40 на 22 — 69%, в то время как цитоплазматическая фракция РНК тех же клеток гибридизируется с Е-нитью лишь на 14 — 16% независимо от штамма клеток (Leong et al., 1976). Во…