18 июля 2012

Эксперименты по транскрипции in vitro

B экспериментах по транскрипции in vitro, в которых в качестве матрицы использовали изолированный хроматин, показано, что при добавлении бактериальной РНК-полимеразы осуществляется преимущественная транскрипция тех же последовательностей, которые транскрибируются in vivo.

Если в качестве матрицы использовать очищенную ДНК из трансформированных клеток, то специфичность транскрипции исчезает и транскрибируется вся ДНК. Активные и неактивные гены, по-видимому, в хроматине имеют разную структуру.

Структура активного гена такова, что последовательности этого гена доступны для транскрипции при добавлении гетерологичной РНК-полимеразы, а структура неактивного гена мешает такой транскрипции. Эти структурные различия могут обусловливаться белками или другими макромолекулами, ассоциированными с ДНК и ограничивающими или усиливающими транскрипцию определенных участков вирусного генома.

В системе in vitro с помощью РНК-полимеразы из Е. соН происходит также асимметрическая транскрипция аденовирусных РНК, списываются те же виды, что и на ранних этапах аденовирусной инфекции. В клетках, трансформированных аденовирусами, транскрибируются только ранние участки аденовирусного генома, причем всего 4 — 10%, т. е. 1 — 5 генов.

Правда, в специальной работе, посвященной анализу посттранскрипционной селекции вирусных мРНК в клетках, трансформированных вирусом А12, Green и соавт. (1976) показали, что ядерная РНК из этих клеток эффективно гибридизировалась с ДНК вируса А12, насыщая от 31 до 38% нуклеотидных последовательностей. Последнее соответствует 62 — 76% двуспиральной ДНК вируса А12. В то же время около 10 — 11% вирусной ДНК А12 насыщается полисомной и цитоплазматической аденовирусной мРНК в условиях значительного избытка последней.

Следовательно, основная масса продуктов транскрипции интегрированного генома вируса А12 или сохраняется в ядре, или распадается и лишь незначительная часть (около 10%) поступает в цитоплазму в виде активной мРНК. Показано, что ядерная аденовирусная РНК, так же как и ядерные РНК паповавирусов, содержит как клеточные, так и вирусные последовательности.

Для ассоциации этих аденовирусных РНК необходимо их предварительное разрезание. Количество ранних аденовирусных мРНК в трансформированных клетках значительно меньше, чем при продуктивной инфекции, и пропорционально числу интегрированных геномов.

В пермиссивной системе к 8-му часу инфекции определяется 300 — 1000 копий ранних аденовирусных мРНК на клетку, и в дальнейшем это число не изменяется, за исключением копий мРНК, кодирующей ДНК-связывающий белок (Flint, Shakp, 1976).

Сопоставление результатов изучения ядерных вирусспецифических РНК-транскриптов и данных анализа ДНК из обработанных ДНКазой I клеток, трансформированных вирусом А5, показало, что последний метод можно применять для анализа вирусных последовательностей, транскрипционно активных и неактивных в геноме трансформированных клеток (Е. И. Фролова и др., 1977). Выявлено, что в трансформированных клетках, содержащих несколько копий определенной последовательности генома А5, возможна транскрипция лишь части копий. В то же время в транскрипции некоторых областей участвуют все копии последовательностей.

На модели ВЭБ показано, что транскрипция 3% последовательностей вирусного генома также достаточно для экспрессии внутриядерного антигена и поддержания трансформированного состояния клеток (Hayward, Kieff, 1976). РНК, полученная из клеток НР-1, продуцирующих ВЭБ, представлена транскриптами с 45% последовательностей вирусной ДНК.

Совпадающие результаты получены при гибридизации РНК из нефракционных клеток НР-1 и полисомной фракции клеток этой линии. В противоположность этому в НП-линиях клеток менее 30% РНК ВЭБ находилось в полисомной фракции.

Представлены данные, позволяющие предполагать о существовании дифференцированного метаболизма вирусспецифической РНК в непермиссивных и трансформированных клетках, который сводится к тому, что лишь определенный класс транскрибируемых последовательностей выявляется в полисомной и поли-А-содержащей РНК ВЭБ.

Те же последовательности РНК ВЭБ присутствуют в полиаденированной и полисомальной фракциях. Это свидетельствует о том, что указанные РНК могут, по-видимому, кодировать функции, связанные с поддержанием трансформированного состояния клеток.

Комплексность этого класса РНК достаточна для кодирования белка, содержащего 5000 аминокислотных остатков (Orellana, K.ieff, 1977). Так как только часть РНК полиаденирована при ограниченной и абортивной инфекции, нельзя исключить того, что полиаденирование или какие-то другие факторы, детерминирующие полиаденирование, могут играть роль в ограниченной экспрессии генома ВЭБ.

«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Метод искусственных гетерокарионов оказался весьма эффективен для многих тест-систем клеток, трансформированных как РНК-, так и ДНК-содержащими онковирусами. В некоторых случаях индикаторные культуры использовали даже для титрования освобожденного вируса по фокусам трансформации, которые он индуцировал (Svoboda et al., 1975). Во всех этих экс-периментах чем больше был процент гетерокарионов, тем выше оказалась эффективность метода. Однако в системах,…

В экспериментах, проведенных А. И. Агеенко и соавт. (1975), из перевивных сарком (с 50-й по 60-ю генерацию), индуцированных у хомяков аденовирусом 12-го типа, полный инфекционный вирус выделялся постоянно. Обнаружено, что при заражении центрифугатами разрушенных клеток перевивных сарком культуры почки эмбриона человека (ПЭЧ) в среднем через 5 дней отмечалось начало цитогенного действия вируса. Из первичноиндуцированных сарком…

Установлена прямая пропорциональность между дозой различных агентов (митомицин С, бромдезоксиуридин, УФ- и 60Со-γ-облучение) и урожаем вируса, освобожденного из трансформированных клеток (Kaplan et al., 1975). Урожай вируса увеличивается по сравнению с контролем в 1000 — 10 000 раз. В линиях — продуцентах инфекционного SV40 доля индуцированных клеток составляла 2 — 6% (по данным определения продукции V-антигена…

Клетки, трансформированные всеми исследованными в настоящее время онкогенными ДНК-содержащими вирусами, в основном являются непермиссивными для полного репродуктивного цикла трансформирующего их вируса, и поэтому естественно, что полный инфекционный вирус ими не продуцируется. Как известно, существуют два крайних ответа пермиссивных клеток природного хозяина при взаимодействии с геномом ДНК-содержащих онковирусов — лизис и трансформация. Трансформация осуществляется тогда, когда…

Итак, по характеру взаимоотношений онковируса с трансформированной клеткой можно выделить следующие типы опухолевых клеток. Вируспродуцирующие клетки. Как правило, это относится к РНК-содержащим вирусам. Вирогенные клетки, в которых удается активировать вирусный геном с помощью различных методических приемов (трансплантации их естественным хозяевам онковируса или при использовании «контактной индукции», т. е. прямого контакта опухолевой клетки с чувствительной «индикаторной»…