11 июля 2012

Использование кинетики реассоциации меченой вирусной ДНК в присутствии немеченой ДНК

Использование кинетики реассоциации меченой вирусной ДНК в присутствии немеченой ДНК из нормальных и трансформированных вирусом полиомы и SV40 клеток хомяка и мыши позволило определить число вирусных ДНК-копий.

Для исследованных культур оно колебалось от 1 до 8,75 в расчете на диплоидный геном, в среднем выявляются два геномных эквивалента вируса. Однако, как выяснилось, частота встречаемости каждого из Нра 1-фрагментов была различна.

Например, клетки мышей SVT2, трансформированные SV40, содержали 6,52 копии фрагмента А, 0,81 — фрагмента В, 5,52 — фрагмента С и 2,04 — фрагмента D. Предполагают, что непрерывный участок генома SV40 (фрагмент В и часть фрагмента D) присутствует в трансформированных клетках в количестве 0,8 копий на диплоидное количество клеточной ДНК, в то время как остальная часть генома (фрагменты А, С и оставшаяся часть D) обнаруживаются в количестве 6 копий (Botchan et al., 1975).

В крысиных клетках, трансформированных вирусом полиомы в дополнение к 6 — 10 копиям вирусного генома, ковалентносвязанным с хромосомальной ДНК, выявлено значительное количество неинтегрированной вирусной ДНК (Prasad et al., 1976). В среднем это количество — 20 копий на клетку — находится в виде суперциркулярных двунитевых молекул, локализованных в ядрах клеток, но не ассоциированных с клеточной ДНК.

При пассировании таких клеток продукция вируса PY в них не наблюдается, но при слиянии их с чувствительными мышиными клетками в них происходит «спасение» вируса. «Свободные» молекулы вирусной ДНК определялись в клетках и в том случае, если трансформация осуществлялась вирусными ts-A- и ts-8-мутантами и клетки после этого выдерживались при температуре 33 °С. Эта «свободная» ДНК, вероятно, присутствовала во всех клетках культуры, поскольку ре-клонирование не изменяло ее уровня.

«Свободная» ДНК оказалась инфекционной, однако ее специфическая активность была в 1000 раз ниже, чем у ДНК из клеток, продуктивно зараженных вирусом PY, что указывает на значительное число дефектов в структуре «свободной» ДНК.

При инфицировании аденовирусом 2-го типа во всех трансформированных линиях клеток было обнаружено до 16% вирусного генома (онкоген) в интегрированной форме в количестве 2 — 6 копий, а в клетках, трансформированных вирусом А5, интегрировался участок, отщепляемый эндонуклеазой Нра I, составляющий около 14% левой части молекулы ДНК. Этот участок был представлен 4 — 5 копиями.

В отношении других фрагментов вирусной ДНК А5 результаты были более вариабельными, так как определялись в различных трансформированных линиях последовательности вирусного генома, отстоящие от левого конца цепи ДНК на 35, 40 и 12% от общей длины генома, т. е. в таких клетках выявлялось от 35 до 45% генома вируса А5.

Реассоциация меченой ДНК вируса А12 с экстрагируемой клеточной ДНК показала, что количество вирусной ДНК в геноме абортивно инфицированных клеток возрастает при увеличении множественности инфекции от 1 — 2 ДНК-копий А12 до 72 копий. При анализе ДНК из трансформированных вирусом А12 клеток обнаружено также наличие 14% левой части вирусного генома в количестве от 10 до 20 копий в зависимости от клеточных линий.

«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Метод искусственных гетерокарионов оказался весьма эффективен для многих тест-систем клеток, трансформированных как РНК-, так и ДНК-содержащими онковирусами. В некоторых случаях индикаторные культуры использовали даже для титрования освобожденного вируса по фокусам трансформации, которые он индуцировал (Svoboda et al., 1975). Во всех этих экс-периментах чем больше был процент гетерокарионов, тем выше оказалась эффективность метода. Однако в системах,…

В экспериментах, проведенных А. И. Агеенко и соавт. (1975), из перевивных сарком (с 50-й по 60-ю генерацию), индуцированных у хомяков аденовирусом 12-го типа, полный инфекционный вирус выделялся постоянно. Обнаружено, что при заражении центрифугатами разрушенных клеток перевивных сарком культуры почки эмбриона человека (ПЭЧ) в среднем через 5 дней отмечалось начало цитогенного действия вируса. Из первичноиндуцированных сарком…

Установлена прямая пропорциональность между дозой различных агентов (митомицин С, бромдезоксиуридин, УФ- и 60Со-γ-облучение) и урожаем вируса, освобожденного из трансформированных клеток (Kaplan et al., 1975). Урожай вируса увеличивается по сравнению с контролем в 1000 — 10 000 раз. В линиях — продуцентах инфекционного SV40 доля индуцированных клеток составляла 2 — 6% (по данным определения продукции V-антигена…

Клетки, трансформированные всеми исследованными в настоящее время онкогенными ДНК-содержащими вирусами, в основном являются непермиссивными для полного репродуктивного цикла трансформирующего их вируса, и поэтому естественно, что полный инфекционный вирус ими не продуцируется. Как известно, существуют два крайних ответа пермиссивных клеток природного хозяина при взаимодействии с геномом ДНК-содержащих онковирусов — лизис и трансформация. Трансформация осуществляется тогда, когда…

Итак, по характеру взаимоотношений онковируса с трансформированной клеткой можно выделить следующие типы опухолевых клеток. Вируспродуцирующие клетки. Как правило, это относится к РНК-содержащим вирусам. Вирогенные клетки, в которых удается активировать вирусный геном с помощью различных методических приемов (трансплантации их естественным хозяевам онковируса или при использовании «контактной индукции», т. е. прямого контакта опухолевой клетки с чувствительной «индикаторной»…