11 июля 2012

Интеграция и освобождение вирусного генома

Интеграция и хромосомная локализация вирусных генов

Ковалентная интеграция вирусного и клеточного геномов, приводящая к образованию единой генетической структуры, является твердо установленным фактом для онковирусов группы папова, аденовирусов и онкорнавирусов.

В отношении вирусов группы герпеса показано, что устойчивые к действию щелочей связи между вирусной и клеточной ДНК отсутствуют, хотя при их взаимодействии могут происходить щелочнолабильные нековалентные связи.

Молекулярная биология располагает несколькими методическими приемами для прямого определения присутствия вирусной ДНК (или ее фрагментов) в геноме клетки: гибридизацией меченой вирусной ДНК с клеточной ДНК, гибридизацией вирусспецифической меченой РНК, синтезированной in vitro при участии РНК-полимеразы из Е. coli на матрице вирусной ДНК, с препаратами ДНК из нормальных и трансформированных клеток, определением кинетики реассоциации.

Наиболее точным и эффективным оказался последний метод гибридизации, позволившей определить истинные количества вирусных копий и их ассоциацию с последовательностями генома трансформированных клеток.

Метод основан на медленной реассоциации (ренатурации) денатурированных двунитевых ДНК со сравнительно низкой молекулярной массой (5Х105 — 5Х106).

Кинетика реассоциации таких фрагментов носит, как правило, двухфазный характер, обусловленный наличием в геноме двух основных типов нуклеотидных последовательностей: повторяющихся и уникальных. Первый тип обусловливает быструю, а второй — медленную ре-ассоциацию.

Предполагают, что уникальные последовательности клеточного генома являются структурными генами, поскольку они образуют гибриды с клеточной РНК и, особенно, с большей частью мРНК Повторяющиеся последовательности ДНК эукариотов можно разделить на три фракции: быструю (сателлитную) часть ДНК, которая повторяется в геноме 1000 — 10 000 раз и более, умеренную, повторяющуюся 100 — 1000 раз, и медленную, повторяющуюся менее 100 раз.

Показано, что сателлитная ДНК состоит в основном из коротких тандемно повторяющихся последовательностей и большая ее часть инертна для транскрипции.

Ей отводят механическую функцию, такую, как участие в связывании, упаковке и спаривании хромосом. Роль умеренной и медленной фракций ДНК менее ясна. Установлено, что часть этой ДНК транскрибируется, а часть выполняет регуляторную функцию.

Очевидно, полицестронность — естественное явление. Механизм генной амплификации помогает основным, существенным белкам избегать давления естественного отбора, вызываемого мутациями. Нельзя исключить, что повторяющиеся последовательности могут составлять фонд, из которого происходят новые белки и возникают новые регуляторные последовательности.

Установлено, что геном онкорнавирусов комплементарен, главным образом последовательностям ДНК с низким уровнем повторяющихся последовательностей (Evans et al., 1977). Оказалось также, что во всех исследованных линиях клеток, трансформированных SV40, вирусная ДНК практически отсутствует во фракции повторяющихся последовательностей и в основном локализована среди уникальных, неповторяющихся, последовательностей (Oren et al., 1976).

Выявлено ограниченное число участков интеграции генома SV40. Небольшие различия в распределении ДНК SV40 по фракциям ДНК разных линий трансформированных клеток свидетельствуют о том, что вирусная ДНК у разных линий клеток локализована в различных участках генома и может иметь преимущественное расположение в геноме клеток той или иной линии.

Например, есть основания полагать, что геном SV40 главным образом локализован в хромосоме С7 трансформированных клеток человека.


«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Метод искусственных гетерокарионов оказался весьма эффективен для многих тест-систем клеток, трансформированных как РНК-, так и ДНК-содержащими онковирусами. В некоторых случаях индикаторные культуры использовали даже для титрования освобожденного вируса по фокусам трансформации, которые он индуцировал (Svoboda et al., 1975). Во всех этих экс-периментах чем больше был процент гетерокарионов, тем выше оказалась эффективность метода. Однако в системах,…

В экспериментах, проведенных А. И. Агеенко и соавт. (1975), из перевивных сарком (с 50-й по 60-ю генерацию), индуцированных у хомяков аденовирусом 12-го типа, полный инфекционный вирус выделялся постоянно. Обнаружено, что при заражении центрифугатами разрушенных клеток перевивных сарком культуры почки эмбриона человека (ПЭЧ) в среднем через 5 дней отмечалось начало цитогенного действия вируса. Из первичноиндуцированных сарком…

Установлена прямая пропорциональность между дозой различных агентов (митомицин С, бромдезоксиуридин, УФ- и 60Со-γ-облучение) и урожаем вируса, освобожденного из трансформированных клеток (Kaplan et al., 1975). Урожай вируса увеличивается по сравнению с контролем в 1000 — 10 000 раз. В линиях — продуцентах инфекционного SV40 доля индуцированных клеток составляла 2 — 6% (по данным определения продукции V-антигена…

Клетки, трансформированные всеми исследованными в настоящее время онкогенными ДНК-содержащими вирусами, в основном являются непермиссивными для полного репродуктивного цикла трансформирующего их вируса, и поэтому естественно, что полный инфекционный вирус ими не продуцируется. Как известно, существуют два крайних ответа пермиссивных клеток природного хозяина при взаимодействии с геномом ДНК-содержащих онковирусов — лизис и трансформация. Трансформация осуществляется тогда, когда…

Итак, по характеру взаимоотношений онковируса с трансформированной клеткой можно выделить следующие типы опухолевых клеток. Вируспродуцирующие клетки. Как правило, это относится к РНК-содержащим вирусам. Вирогенные клетки, в которых удается активировать вирусный геном с помощью различных методических приемов (трансплантации их естественным хозяевам онковируса или при использовании «контактной индукции», т. е. прямого контакта опухолевой клетки с чувствительной «индикаторной»…