9 июля 2012

Картирование ранней цитоплазматической мРНК вируса PY

Картирование ранней цитоплазматической мРНК вируса PY показало, что 5´-конец располагается на границе Е- и С-фрагментов ДНК, полученных при помощи ре-стриктазы Нра II, в точке 72 ед. карты от точки разрыва Е. coli RI, а 3´-конец — во фрагменте на расстоянии 25 — 26 ед. карты. Ядра из клеток ЗТЗ (пермиссивная система) через 30 ч после инфекции вирусом полиомы содержат полные транскрипты L-нити и как минимум 75% Е-нити. Поздняя цитоплазматическая мРНК включает транокрипты Е-нити, неотличимые от тех, которые обнаруживаются на ранних стадиях инфекции, и большие концентрации вирусной РНК, гибридизирующейся с 50% L-нити. 5´-конец этой РНК находится в положении 70 — 72 ед. карты, а З´-конец — 25 ед. карты во фрагменте F.

При седиментационном анализе в водных растворах сахарозы установлено, что ранняя мРНК вируса PY представлена в основном 19S мРНК, содержащей блоки поли-А с молекулярной массой 7Х105. Эта мРНК способна кодировать один или несколько полипептидов с молекулярной массой 70 000.

Кроме этого вида 19S мРНК обнаружены еще два вида ранних мРНК — 16S и 19S, содержащие также сегменты поли-А. На поздней стадии инфекции около 60 — 80% мРНК PY несли после  довательности поли-А. Выделены два вида поздних м-РНК — 16S и 19S (Rosenthal, 1976).

Поздние цитоплазмотические РНК использовали в системе бесклеточной трансляции in vitro. 16S РНК кодировала синтез только основного капсидного белка VP1, трансляция 19S РНК приводила к образованию VP2 и незначительного количества VP1.

Для изучения генетической локализации капсидных белков вируса полиомы Whuler и соавт. (1977) исследовали их синтез в бесклеточной системе при трансляции РНК, комплементарной различным Нра П-фрагментам ДНК PY. РНК, кодирующая капсидные белки, считывается с 1-го и 3-го фрагментов, но не со 2-го и 4-го, т. е. с поздних генов вируса полиомы.

Проведено исследование влияния бактериальных рестриктирующих нуклеаз на геном паповавирусов.

Экзонуклеаза из Н. aegyptis III (Hae III), например, узнает и разрезает специфическую нуклеотидную последовательность 5´… Г — Г — Ц — Ц, 3´…Ц — Ц — Г —Г и приводит к образованию 18 фрагментов после обработки ДНК SV40, 10 из которых крупные, а 8 мелкие. Рестриктаза из Arthrobacter luteus (Alu) узнает последовательность 5´…А — Г —Ц — Т…З´, 3´…Г — ЦГ — А…5´.

Участок узнавания, таким образом, идентичен центральному участку последовательности, узнаваемой рестриктазой Hind III (Yang et al., 1976). Следовательно, все фрагменты Hind III разрезаются также и рестриктазой Alu.

Обработка ДНК SV40 рестриктазой Alu приводит к образованию 32 фрагментов, варьирующих по размеру от 0,26 до 14,2% от размера тотального вирусного генома. Из 32 фрагментов 20 крупные (AluA→AluT), a 12 мелкие (AlumiAlums). Указанное количество сегментов является наибольшим для одной рестриктазы.

Физический порядок фрагментов Alu определяли с помощью перекрывающего анализа продуктов двойного разрезания в результате реципрокного переваривания Alu — Hind и Alu — Hae. После этого сконструирована циркулярная карта фрагментов Alu в геноме SV40 относительно уже известного порядка фрагментов Hind и Hae (Yang et al., 1976).

«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Метод искусственных гетерокарионов оказался весьма эффективен для многих тест-систем клеток, трансформированных как РНК-, так и ДНК-содержащими онковирусами. В некоторых случаях индикаторные культуры использовали даже для титрования освобожденного вируса по фокусам трансформации, которые он индуцировал (Svoboda et al., 1975). Во всех этих экс-периментах чем больше был процент гетерокарионов, тем выше оказалась эффективность метода. Однако в системах,…

В экспериментах, проведенных А. И. Агеенко и соавт. (1975), из перевивных сарком (с 50-й по 60-ю генерацию), индуцированных у хомяков аденовирусом 12-го типа, полный инфекционный вирус выделялся постоянно. Обнаружено, что при заражении центрифугатами разрушенных клеток перевивных сарком культуры почки эмбриона человека (ПЭЧ) в среднем через 5 дней отмечалось начало цитогенного действия вируса. Из первичноиндуцированных сарком…

Установлена прямая пропорциональность между дозой различных агентов (митомицин С, бромдезоксиуридин, УФ- и 60Со-γ-облучение) и урожаем вируса, освобожденного из трансформированных клеток (Kaplan et al., 1975). Урожай вируса увеличивается по сравнению с контролем в 1000 — 10 000 раз. В линиях — продуцентах инфекционного SV40 доля индуцированных клеток составляла 2 — 6% (по данным определения продукции V-антигена…

Клетки, трансформированные всеми исследованными в настоящее время онкогенными ДНК-содержащими вирусами, в основном являются непермиссивными для полного репродуктивного цикла трансформирующего их вируса, и поэтому естественно, что полный инфекционный вирус ими не продуцируется. Как известно, существуют два крайних ответа пермиссивных клеток природного хозяина при взаимодействии с геномом ДНК-содержащих онковирусов — лизис и трансформация. Трансформация осуществляется тогда, когда…

Итак, по характеру взаимоотношений онковируса с трансформированной клеткой можно выделить следующие типы опухолевых клеток. Вируспродуцирующие клетки. Как правило, это относится к РНК-содержащим вирусам. Вирогенные клетки, в которых удается активировать вирусный геном с помощью различных методических приемов (трансплантации их естественным хозяевам онковируса или при использовании «контактной индукции», т. е. прямого контакта опухолевой клетки с чувствительной «индикаторной»…