14 мая 2012

Ферменты

Ферменты – это специфические белки, способные ускорять химические реакции. Они входят в состав всех клеток и тканей живых организмов. Ферменты исполняют функцию биологических катализаторов.

С вирионами онкорнавирусов ассоциировано более 10 ферментов, которые выявляются по своей активности, однако не тестируются в биохимических или иммунологических методиках, использующихся для исследования полипептидного состава вирусных частиц. Таким образом, в настоящее время нет возможности связать какую-либо ферментативную активность с определенным белком вириона.

Единственное исключение составляет ферментный комплекс, катализирующий синтез ДНК на матрице РНК — РНК- и ДНК-зависимые ДНК-полимеразы, или, как принято сейчас называть этот комплекс, обратная транскриптаза, ревертаза.

Отсюда и другое название всей группы вирусов — ретравирусы.

Обратная транскриптаза ассоциирована с сердцевиной вирионов.

Этот фермент содержит практически все исследованные онкорнавирусы, бластомогенные потенции которых доказаны.

Помимо этих вирусов, обратная транскриптаза обнаружена у некоторых вирусов и вирусных частиц, онкогенность которых пока не установлена. К ним относятся «пенящие» вирусы млекопитающих, «медленные» вирусы овец, частицы R-типа, хомяков, частицы из лейкозных тканей и молока человека, вирус змей, вирус ящура и один из вирусов (австралийский антиген), встречающийся при инфекционном гепатите человека.

В настоящее время обратная транскриптаза выделена в препаративных количествах и очищена из следующих онкорнавирусов птиц и млекопитающих: миелобластоза, саркомы Рауса, лейкоза Раушера и Фрейд, лейкоза кошек, В-типа мышей, саркомы и лейкоза обезьян и Мезона — Пфайзера.

Уровень очистки ферментного комплекса из разных вирусов находится в пределах 50 — 1000 раз с выходом 1 — 10%. Все очищенные препараты из перечисленных онкорнавирусов обладают как РНК-зависимой, так и ДНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью, а также активностью РНКазы Н, которая в этом комплексе действует как процессивная экзонуклеаза.

Подсчитано, что около 0,4% белка вириона приходится на белок ревертазы и вирус содержит приблизительно 40 молекул ДНК-полимеразы (Krakower et al., 1977).

Очищенная ревертаза онкорнавирусов птиц выделена в двух формах. Молекулы одной формы состоят из двух полипептидных цепей, α- и β-субъединиц, имеющих молекулярную массу соответственно 65 000 — 70 000 и 105 000 — 120 000, другой — только из α-субъединиц. В одном вирионе RSV может содержаться 2 — 5, а в вирионе AMV — 5 — 17 молекул фермента.

Описан механизм освобождения активной α-субъединицы из димерной αβ-формы (3-я форма) ДНК-полимеразы AMV (Papas et al., 1976). Обе формы обладают ДНК- и РНК-зависимой ДНК-полимеразными (а также Н-РНКазной) примерно равными активностями. Из штамма В77 RSV изолированы β-субъединицы, которые, как было показано, фосфорилированы (Hizi et al., 1977).

Все формы ревертазы (α, α β и β2) транскрибировали 70S РНК вируса В77 одинаково эффективно. Синтезируемые продукты имели одинаковые размеры (в основном 4 — 12S, а некоторые транскрипты — 18S). Эти формы фермента обладали активностью РНКазы Н, относительная удельная активность которой в α- β2— и αβ-формах около 1:4:5. Следовательно, можно предположить, что β-полипептидная цепь обратной транскриптазы онкорнавирусов птиц не есть просто структура, модифицирующая сродство a-полимеразы к субстрату и матрице-затравке, а является ферментативно активной формой.

Правда, по данным некоторых авторов, препарат β-субъединицы обладает очень слабой полимеразной и РНКазной активностью, но способность связываться с матрицей у этой субъединицы выражена гораздо сильнее, чем у α-субъединицы (Gradgenett, 1976; Hizi et al., 1977). Вместе с тем представлены данные, согласно которым по многим параметрам свойства димерных форм ДНК-полимеразы значительно ближе друг к другу, чем к свойствам α-формы ревертазы (Hizi et aL, 1977).

В отношении очень важных параметров, таких как сродство фермента к вирусной РНК и размер синтезированного по этой матрице ДНК-транскрипта (с максимальной длиной в 4500 нуклеотидов), αβ-формы ревертазы значительно активнее двух других форм и, очевидно, поэтому ар-форма биологически наиболее важна.


«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



SSV и GLV приматов относятся ко II классу экзогенных вирусов С-типа, так как оба вируса были изолированы из опухолей обезьян и онкогенны для своих хозяев, т. е. при инъекциях индуцируют неоплазии. Геном этих вирусов не имеет комплементарных последовательностей в ДНК клеток приматов, передается горизонтально и обнаруживается в лимфомах, саркомах и при лейкозах. Ревертазы этих вирусов…

Родственные отношения между различными онкорнавирусами во многих работах исследовались методом молекулярной гибридизации. Чаще всего для этой цели использовали гибридизацию между меченой вирионной РНК и избытком синтезированного в присутствии актиномицина D in vitro 3Н-ДНК-продукта. Уровень образования ДНК — РНК-гибридов контролировали с помощью нуклеазы Sb специфичной в отношении однонитевой ДНК. Оказалось, что все исследованные эндогенные вирусы различных…

Весьма существенно, что при инфекции экзогенными онкорнавирусами во многих системах, например, клеток кошек вирусом FeLV или клеток крыс вирусами приматов, происходит активация эндогенных вирусов. Подобное тестирование синтеза РНК эндогенных вирусов в инфицированных клетках методом молекулярной гибридизации можно использовать для исследования вновь выделенных вирусов. Кроме того, 3Н-ДНК-продукты могут найти широкое применение для обнаружения включения генетического материала…

Установлено, что представители онкорнавирусов 5 основных субгрупп (А, В, С, D и Е) иммунологически неотличимы по р27 при гомологичном типировании, осуществляемом с помощью радиоиммунологического теста. Напротив, у каждого из трех низкомолекулярных вирусных полипептидов (р19, р15, р12) выявлены типоспецифические детерминанты. Оказалось, что представители субгрупп А, В и Е содержат идентичную генетическую информацию, ответственную за синтез низкомолекулярных…

Масса вирионов онкорнавирусов равна приблизительно 450X106. Вирионы термолабильны и инактивируются эфиром и другими растворителями липидов, так как окружены мембраной, содержащей значительное количество липидов. Например, в состав вириона миелобластоза птиц входит 2,5% РНК, 35% липидов и около 60% белка. Вирус Биттнера содержит 30% липидов, 2% РНК и 68 белка. Фосфолипиды вирионов онкорнавирусов значительно отличаются по составу…