22 июня 2012

Содержание вирусспецифической нити РНК

Содержание вирусспецифической нити РНК, комплементарной геномной РНК (негативная), в клетках находится на очень низком уровне. Stavnerer и соавт. (1976) предложили метод их выделения.

В качестве модели использовали RSV штамм В77 и MTV.

Негативная РНК обнаружена в ядре и цитоплазме инфицированных клеток, а также в составе популяции РНК вирионов В77.

Эта РНК из ядер гибридизировалась с 30% генома В77 и 45% генома MTV, в то время как негативная РНК из цитоплазмы в обоих случаях гибридизировалась с 20% вирусного генома, а в составе вириона В77 — с 15% генома этого вируса. Подсчитано, что плюс-нити РНК составляют 0,3 — 0,5% в ядерной РНК и 0,1 — 0,3% в цитоплазменной РНК, а уровень негативной РНК 0,005% и 0,0005% соответственно.

Клетки, зараженные вирусами саркомно-лейкозного комплекса мышей, содержат два типа вирусспецифических мРНК, седиментирующих в градиенте сахарозы в зонах 35S и 20S (иногда, за редким исключением, минорные пики выявлялись в зонах 14S и 26 — 28S).

В трансформированных же вирогенных клетках неприродного хозяина, не продуцирующих вирус, определялись только вирусные 33S мРНК. Конкурентная гибридизация показала, что 35S РНК из клеток полностью гомологична 35S-субъединицам вирионной РНК, в то время как 33S РНК из вирогенных клеток, в которых находился полный вирусный геном, содержала только часть последовательностей вирионной 70S РНК.

Все типы вирусной РНК обнаружены и в полисомах инфицированных клеток, т. е. вполне вероятно, что эти РНК транслируют синтез определенных вирусспецифических белков, не все из которых, очевидно, в настоящее время еще идентифицированы. 20S РНК не является продуктом деградации 35S РНК, а представляет собой самостоятельный тип РНК, обеспечивающий важные этапы в репродукции вирионов — синтез белков оболочки (этот тип РНК определяется только в вируспродуцирующих клетках).

Установлено, что приблизительно 1 % РНК в вируспродуцирующих клетках является вирусспецифической и около 1/3 этих вирусных последовательностей ассоциировано с ядерной фракцией (Haseltine Baltimore, 1976).

Для определения размеров такой РНК тотальный препарат ядерной РНК подвергали фракционированию в градиенте сахарозы, а затем отдельные фракции гибридизации с 3Н-ДНК-продуктом MuLV.

При центрифугировании в неденатурирующих условиях вирусная ядерная РНК седиментирует весьма гетерогенно в зоне от 10S до 100S. Это распределение отличалось от распределения цитоплазматической РНК, при котором основная масса молекул была представлена 35S-PHK.

После денатурации (т. е. после центрифугирования в градиенте сахарозы с диметилсульфоксидом) ядерная вирусная РНК представлена в основном 35S-компонентом со значительным количеством низкомолекулярных РНК.

Небольшая фракция (2 — 5%) ядерной РНК седиментирует быстрее, чем 35S-PHK после денатурации. Эти быстро седиментирующие вирусные РНК, вероятно, представляют собой неполный предшественник 35S-PHK.

«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Количественные определения в опытах с использованием импульсной метки, а также данные, полученные с ингибиторами белкового синтеза и канаванином, говорят о том, что протеолитическое расщепление Рrlа + b является первым путем образования промежуточных предшественников обратной транскриптазы — PrRTl, 2 и 3. Вместе с тем неясно, играет ли какую-то роль этот путь расщепления в образовании продуктов gag-гена….

Определен полный аминокислотный состав р30 вирусов С-типа мышей, кошек, крыс и обезьян, свидетельствующий о сходстве этих белков по этому критерию. Белок р30 богат остатками аминокислот с полярными боковыми цепями (лизин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты или их амиды), беден цистеином, метионином, гистидином и изолейцином. Исследование первых 30 остатков с NН2-конца р30 показало высокий уровень родства…

Основная масса вирусспецифических полипептидов синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах, а часть находится во фракции свободных полирибосом, где и происходит их синтез. Методом иммунопреципитации пептидов удалось определить размеры этих полирибосом — 350S. Эта величина свидетельствует о том, что вирусные мРНК транслируются на полирибосомах, состоящих из 12 монорибосом. На полирибосомах такого размера могут транслироваться мРНК с молекулярной массой…

Продолжая эти исследования, Pawson и соавт. (1977) установили, что в бесклеточной белоксинтезирующей системе (использовали либо асцитные, либо клетки L) белок, синтезируемый геномной 30 — 40S-PHK RSV, имел молекулярную массу 76 000 и осаждался антисывороткой к разрушенному вирусу и р12, р30, но не антисывороткой к gp85. Смотрите — Трансляция РНК онкорнавирусов in vivo Следовательно, Рr76 является…

В клетках, зараженных R — MuLV, идентифицировано несколько быстрометящихся нестабильных высокомолекулярных белков: Prla±b (с массой около 200 000) — предшественник р30, р15, р12, р 10 и обратной транскриптазы; Prla±b (с массой около 90 000) — предшественник gp69/71, p 15(Е) и р12(Е); Рr3 (с массой около 80 000) и Рг4 (с массой около 70 000) —…