22 июня 2012

Экспрессия генома онкорнавирусов и ее контроль

На различных системах клеток, нормальных и трансформированных (спонтанно и под воздействием концерогенных факторов разной природы), были установлены три типа экспрессии вирусного генома, включенного в хромосомы и начавшего функционировать и реплицироваться вместе с генами хозяина.

К первому типу относятся полная транскрипция и трансляция вирусного генома, обусловливающая спонтанную продукцию инфекционного вируса, второй тип характеризуется частичной экспрессией вирусной информации, которая, например, может проявляться в синтезе только gs-антигенов, и третий тип связан с полной репрессией вирусного генома. В последнем случае с помощью различных индукторов иногда удается в той или иной степени активировать вирусные гены.

Транскрипция ДНК-провируса

До недавнего времени не удавалось стабильно выделять из зараженных и трансформированных онкорнавирусами клеток вирусспецифическую РНК.

Объясняется это многими методическими трудностями, главная из которых обусловлена невозможностью торможения синтеза клеточных нуклеиновых кислот, поскольку репликация онкорнавирусов блокируется актиномицином D. Однако с открытием обратной транскриптазы были разработаны новые перспективные подходы, связанные с синтезом in vitro 3Н-ДНК-продукта, который затем использовали для анализа ядерных и цитоплазматических РНК нормальных, зараженных и трансформированных онкорнавирусами клеток.

Полученные данные свидетельствуют о том, что РНК онкорнавирусов синтезируется в ядре зараженных клеток с помощью клеточной полимеразы, используя интегрированную вирусную ДНК в качестве матрицы.

Подсчитано, что вирусспецифическая РНК онкорнавирусов птиц в инфицированных и неинфицированных куриных клетках составляет 0,6 — 0,9% и 0,05% от тотального количества РНК соответственно (Hayward, Hanafusa, 1973; Varmus et al., 1973).

Использование 3Н-ДНК-продуктов RSV, эндогенного вируса RAV-0 и 3Н-ДНК-копий отдельных вирусных генов (gag, pol, env, sarc, С — общий участок между поли-А и sarc) позволило идентифицировать РНК-транскриптаты всех вирусных генов в клетках птиц, зараженных RSV (Hayward, 1977).

Подсчитано, что для гена gag количество копий РНК на клетку в случае инфекции RAV-0 составляет 1600, в случае инфекции RAV-2 — 9800, в случае инфекции SR — RSV — 10 000, для гена pot — 1700, 9400 и 10200 соответственно, для гена env 3300, 16 000 и 20 000, для гена sarc для нормальных и RAV-2 зараженных клеток — 7, для клеток, зараженных RSV — 18000, для гена С в тех же клетках — 17 000 и 19 000.

В клетках, инфицированных RSV, обнаружены 39S и 21S РНК. 39S РНК гибридизируется со всеми ДНК-копиями, a 21S представляет собой популяцию молекул, часть из которых специфична sarc, а другая часть — env.

Установлено, что в незараженных клетках трех типов (gs+, chf+, he — тип клеток с низким уровнем экспрессии gs-антигенов и высоким уровнем хелперной активности, gs-chf-) от 60 до 80% вирусспецифическая РНК содержит поли-А.

Эта РНК в gs+ chf+ клетках представлена 2 компонентами — 31S и 21S, в he клетках — 35S и 2IS, в gschf клетках количество вс-РНК очень мало и эта РНК выявляется в зоне 28 — 35S без каких-либо четких пиков.

Разница между 31S РНК и 35S РНК в gs+chf+ и he клетках соответствует 1900 нуклеотидов и свидетельствует о том, что часть генов gag и pol отсутствует в 31S РНК.

Это хорошо согласуется с данными об отсутствии активной обратной транскриптазы в нормальных клетках и об отсутствии белка р15 в gs+chf+ клетках.

Вероятно, геном эндогенного RAV-0 имеет делению, затрагивающую 3´ — конец гена gag, кодирующего р 15, и прилетающую часть гена pol.

PHKsarc из нормальных клеток кур обладали одинаковым размером около 26S (Wang San et al., 1977). Поскольку величина транскрипта гена sarc 16 — 18S, т. е. значительно меньше, предполагают, что эта РНК представляет собой контраскрипт с определенных клеточных генов.

«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Определен полный аминокислотный состав р30 вирусов С-типа мышей, кошек, крыс и обезьян, свидетельствующий о сходстве этих белков по этому критерию. Белок р30 богат остатками аминокислот с полярными боковыми цепями (лизин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты или их амиды), беден цистеином, метионином, гистидином и изолейцином. Исследование первых 30 остатков с NН2-конца р30 показало высокий уровень родства…

Количественные определения в опытах с использованием импульсной метки, а также данные, полученные с ингибиторами белкового синтеза и канаванином, говорят о том, что протеолитическое расщепление Рrlа + b является первым путем образования промежуточных предшественников обратной транскриптазы — PrRTl, 2 и 3. Вместе с тем неясно, играет ли какую-то роль этот путь расщепления в образовании продуктов gag-гена….

Основная масса вирусспецифических полипептидов синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах, а часть находится во фракции свободных полирибосом, где и происходит их синтез. Методом иммунопреципитации пептидов удалось определить размеры этих полирибосом — 350S. Эта величина свидетельствует о том, что вирусные мРНК транслируются на полирибосомах, состоящих из 12 монорибосом. На полирибосомах такого размера могут транслироваться мРНК с молекулярной массой…

Продолжая эти исследования, Pawson и соавт. (1977) установили, что в бесклеточной белоксинтезирующей системе (использовали либо асцитные, либо клетки L) белок, синтезируемый геномной 30 — 40S-PHK RSV, имел молекулярную массу 76 000 и осаждался антисывороткой к разрушенному вирусу и р12, р30, но не антисывороткой к gp85. Смотрите — Трансляция РНК онкорнавирусов in vivo Следовательно, Рr76 является…

В клетках, зараженных R — MuLV, идентифицировано несколько быстрометящихся нестабильных высокомолекулярных белков: Prla±b (с массой около 200 000) — предшественник р30, р15, р12, р 10 и обратной транскриптазы; Prla±b (с массой около 90 000) — предшественник gp69/71, p 15(Е) и р12(Е); Рr3 (с массой около 80 000) и Рг4 (с массой около 70 000) —…