20 июня 2012

Максимальная активность ДНК-полимераз

Установлено, что каждая ДНК-полимераза максимальной активностью обладает при использовании определенного типа синтетических полинуклеотидных матриц, причем активность каждого фермента при участии оптимальной для него матрицы оказывалась приблизительно в 15 раз выше активности остальных обратных транскриптаз.

Таким образом, применение синтетических матриц типа поли-рА: олито-дТ12-18, с одной стороны, позволили увеличить чувствительность полимеразной реакции, а с другой, использовать их для выявления ДНК-полимеразы онкорнавирусов.

Чувствительность этого теста оказалась во много раз выше чувствительности различных биологических тестов. Следовательно, вирусные и клеточные ДНК-полимеры можно дифференцировать, с одной стороны, по критерию специфического взаимодействия их с различными олигомергомополимерными искусственными матрицами, а с другой, по способности вирусных ревертаз использовать в качестве матрицы вирусную 70S РНК.

Кроме того, показана возможность угнетения вирусных ревертаз односпиральными синтетическими полирибонуклеотидами, которые не оказывали подобного действия на клеточную ДНК-полимеразу. Наконец, обнаружено уникальное свойство ревертаз С-типа млекопитающих — способность ингибироваться неорганическим фосфатом. Это открывает новые возможности для дифференцировки источника и природы этих ферментов (Modak, Marcus, 1977).

В трансформированных клетках определялись три ДНК-полимеразы, две из которых соответствуют полимеразам нормальных клеток (I и II), а третья (III) оказалась идентичной по свойствам вирусной обратной транскриптазе (Parks et al., 1972).

Антисыворотка к очищенной вирусной РНК-зависимой ДНК-полимеразе блокирует фермент III из трансформированных клеток, не изменяя активности полимераз I и II.

Этот эффект специфических антисывороток может быть использован в терапевтических целях. По-видимому, только вирусная РНК-зависимая ДНК-полимераза и соответствующая ей ДНК-полимераза III из трансформированных клеток имеют прямое отношение к опухолевой трансформации клеток под действием онкорнавирусов.

Три ДНК-полимеразы выделены из гомогенатов 7-дневных эмбрионов цыплят и очищены 200 — 300 раз. Две формы с коэффициентами седиментации 10S (P3-L) и 3 — 4S (P3-S) получены из фракции микросом и одна — из растворимой фракции клеток (10S). ДНК-полимеразы P3-S и вируса саркомы Рауса в качестве матрицы активнее использовали поли-рА: олиго-дТ, чем поли-дА: олиго-дТ, и могли работать на вирусной РНК в отличие от ДНК-полимераз P3-L и 10S (Mizutani, 1973).

Наличие в клетках эмбрионов цыплят ДНК-полимеразы P3-S, существующей в комплексе с РНК, и способность этого фермента использовать РНК в качестве матрицы для синтеза ДНК позволяют предположить, что при нормальном развитии клетки происходит перенос информации с РНК на ДНК

Из клеток крыс линии ХС, трансформированных RSV, выделена новая ДНК-полимераза с молекулярной массой 70 000 (δ-ДНК-полимераза), отличающаяся от α-, β- и γ-ДНК-полимераз эукариот не только по размерам, но и по матричной специфичности и профилю элюции при аффинной хроматографии (Bandyopadhyay, 1975). δ-ДНК-полимераза имеет много общего с обратной транскриптазой вируса лейкоза мышей и ревертазой эндогенного вируса крыс, однако отличается от двух последних полимераз неспособностью транскрибировать олиго-дГ12: поли-рЦ. δ-ДНК-полимераза не блокировалась IgG из антисыворотки крысы к ревертазе вируса миелобластоза птиц.

Таким образом, попытка обнаружить вирусную полимеразу в клетках млекопитающих, трансформированных RSV и непродуцирующих вирус, оказалась неудачной. Вместе с тем нельзя исключить, что выявленная в таких клетках δ-ДНК-полимераза может быть предшественником или модифицированной формой обратной транскриптазы онкорнавирусов птиц.

Итак, обратная транскриптаза онкорнавирусов отличается от клеточных ДНК-полимераз и кодируется вирусным геномом.

Фермент этот присутствует или в вирионах онкорнавирусов или в клетках (необязательно вируспродуцирующих), в которых, однако, происходит экспрессия (полная или частичная) вирусного генома. До сих пор неясно отношение вирусной ревертазы к другим типам обратных транскриптаз, которые обнаруживаются в некоторых нормальных, главным образом эмбриональных, клетках.

Наличие обратных транскриптаз в опухолевых клетках человека, по-видимому, свидетельствует об экспрессии вирусных генов.

Тем не менее, вероятнее всего, вирусный обратнотранскриптазный комплекс является необходимым компонентом инициации (но не поддержания) опухолевой трансформации, индуцированной онкорнавирусами.

«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Количественные определения в опытах с использованием импульсной метки, а также данные, полученные с ингибиторами белкового синтеза и канаванином, говорят о том, что протеолитическое расщепление Рrlа + b является первым путем образования промежуточных предшественников обратной транскриптазы — PrRTl, 2 и 3. Вместе с тем неясно, играет ли какую-то роль этот путь расщепления в образовании продуктов gag-гена….

Определен полный аминокислотный состав р30 вирусов С-типа мышей, кошек, крыс и обезьян, свидетельствующий о сходстве этих белков по этому критерию. Белок р30 богат остатками аминокислот с полярными боковыми цепями (лизин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты или их амиды), беден цистеином, метионином, гистидином и изолейцином. Исследование первых 30 остатков с NН2-конца р30 показало высокий уровень родства…

Основная масса вирусспецифических полипептидов синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах, а часть находится во фракции свободных полирибосом, где и происходит их синтез. Методом иммунопреципитации пептидов удалось определить размеры этих полирибосом — 350S. Эта величина свидетельствует о том, что вирусные мРНК транслируются на полирибосомах, состоящих из 12 монорибосом. На полирибосомах такого размера могут транслироваться мРНК с молекулярной массой…

Продолжая эти исследования, Pawson и соавт. (1977) установили, что в бесклеточной белоксинтезирующей системе (использовали либо асцитные, либо клетки L) белок, синтезируемый геномной 30 — 40S-PHK RSV, имел молекулярную массу 76 000 и осаждался антисывороткой к разрушенному вирусу и р12, р30, но не антисывороткой к gp85. Смотрите — Трансляция РНК онкорнавирусов in vivo Следовательно, Рr76 является…

В клетках, зараженных R — MuLV, идентифицировано несколько быстрометящихся нестабильных высокомолекулярных белков: Prla±b (с массой около 200 000) — предшественник р30, р15, р12, р 10 и обратной транскриптазы; Prla±b (с массой около 90 000) — предшественник gp69/71, p 15(Е) и р12(Е); Рr3 (с массой около 80 000) и Рг4 (с массой около 70 000) —…