18 июня 2012

Обратнотранскриптазная активность и трансформация (дефектность онкорнавирусов по ДНК-полимеразе)

Необходимость ДНК-полимер азы в проявлении инфекционности онкорнавирусов и в опухолевой трансформации, индуцированной ими, весьма убедительно обоснована в опытах на разных клонах RSVα0, дефектных по ревертазе (Н. Hanafusa, Т. Hanafusa, 1971).

У штамма Hanafusa — Hanafusa отсутствовали обе активности фермента (РНК- и ДНК-зависимых ДНК-полимераз), а в вирионах штамма Robinson-Robinson — активность только РНК-зависимой ДНК-полимеразы. Важно подчеркнуть, что клетки, трансформированные штаммом Hanafusa — Hanafusa RSVa0 (в том случае, когда суперинфицирующий вирус лейкоза передавал α-типу RSV обе полимеразные активности), не отличаются по биологическим характеристикам от клеток, трансформированных β-типом RSV (недефектным по ревертазе).

Следовательно, присутствие РНК- и ДНК-зависимых ДНК-полимераз необходимо для развития трансформации, но не для ее поддержания. Аналогичная взаимосвязь дефицита вирусной ревертазы с проявлением инфекционных и трансформирующих свойств была выявлена и на других видах онкорнавирусов, в частности на различных штаммах MSV, SSV (Peebles et al., 1972; Krakower et al., 1977).

Принципиальное значение для обоснования участия вирусных обратных транскриптаз в процессе опухолевой трансформации приобретает вопрос об общности и отличиях ревертаз нормальных и бластоматозных клеток.

Дело в том, что к настоящему времени РНК-зависимые ДНК-полимеразы получены из клеток перевиваемых опухолей, тканей животных, зараженных онкорнавирусами, трансформированных клеток и клеток, инфицированных РНК-содержащими онкогенными вирусами in vitro. Кроме того, обратные транскриптазы обнаружены во фракциях частиц сыворотки крови от некоторых больных с хроническими и острыми лимфо- и миелолейкозами.

Наконец, существенно, что ревертазы выявлены в незараженных клетках животных, нормальных лимфобластах и лимфоцитах человека, стимулированных фитогемагглютинином (ФГА), а также в культуре фибробластов человека (в последнем случае, правда, в 8 — 9 раз меньшем количестве, чем в инфицированных онкорнавирусами клетках).

Обратные транскриптазы, содержащиеся в вирионах онкорнавирусов и обнаруженные в лейкозных тканях человека, обладают некоторыми общими свойствами.

Вероятно, они имеют одинаковую молекулярную массу, так как при гельфильтрации элюировались с колонок в одинаковых объемах, в качестве субстрата могут использовать синтетические двуспиральные рибогомополимеры, в равной степени блокируются производными рифампицина и не ингибируются рифампицином.

Вместе с тем за последние годы представлены данные о том, что вирусные обратные транскриптазы можно дифференцировать от клеточных ДНК-полимераз (из нормальных лимфоцитов человека) по их способности использовать в качестве матрицы вирусную 70S РНК.

При добавлении к этой матрице коротких олигонуклеотидов типа олиго-дТ10 активность вирусных ревертаз оказывалась в 15 раз выше активности клеточных ревертаз.

Последние плохо функционировали как при использовании только 70S РНК, так и в смеси 70S РНК с олиго-дТ10 (Robert et al., 1972; Gallo et al., 1973, 1975). При использовании высокоочищенных препаратов 70S РНК (без примеси ДНК) клеточные ДНК-полимеразы совсем не синтезировали ДНК на этой матрице.

Помимо этого, в системе, в которой функционировала эндогенная ДНК-полимераза во фракции лимфоцитов человека, стимулировались ДНК — РНК-гибриды.


«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Количественные определения в опытах с использованием импульсной метки, а также данные, полученные с ингибиторами белкового синтеза и канаванином, говорят о том, что протеолитическое расщепление Рrlа + b является первым путем образования промежуточных предшественников обратной транскриптазы — PrRTl, 2 и 3. Вместе с тем неясно, играет ли какую-то роль этот путь расщепления в образовании продуктов gag-гена….

Определен полный аминокислотный состав р30 вирусов С-типа мышей, кошек, крыс и обезьян, свидетельствующий о сходстве этих белков по этому критерию. Белок р30 богат остатками аминокислот с полярными боковыми цепями (лизин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты или их амиды), беден цистеином, метионином, гистидином и изолейцином. Исследование первых 30 остатков с NН2-конца р30 показало высокий уровень родства…

Основная масса вирусспецифических полипептидов синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах, а часть находится во фракции свободных полирибосом, где и происходит их синтез. Методом иммунопреципитации пептидов удалось определить размеры этих полирибосом — 350S. Эта величина свидетельствует о том, что вирусные мРНК транслируются на полирибосомах, состоящих из 12 монорибосом. На полирибосомах такого размера могут транслироваться мРНК с молекулярной массой…

Продолжая эти исследования, Pawson и соавт. (1977) установили, что в бесклеточной белоксинтезирующей системе (использовали либо асцитные, либо клетки L) белок, синтезируемый геномной 30 — 40S-PHK RSV, имел молекулярную массу 76 000 и осаждался антисывороткой к разрушенному вирусу и р12, р30, но не антисывороткой к gp85. Смотрите — Трансляция РНК онкорнавирусов in vivo Следовательно, Рr76 является…

В клетках, зараженных R — MuLV, идентифицировано несколько быстрометящихся нестабильных высокомолекулярных белков: Prla±b (с массой около 200 000) — предшественник р30, р15, р12, р 10 и обратной транскриптазы; Prla±b (с массой около 90 000) — предшественник gp69/71, p 15(Е) и р12(Е); Рr3 (с массой около 80 000) и Рг4 (с массой около 70 000) —…