12 июня 2012

Модель синтеза ДНК

На основании имеющегося экспериментального материала была предложена следующая модель синтеза ДНК. Начальный этап ДНК происходит в репликационном комплексе, содержащем молекулы ДНК, связанные водородными связями с молекулами вирусной РНК.

Каждая молекула ДНК вытесняется как однонитевая молекула (минус-нить) в результате синтеза последующей минус-нити ДНК.

Синтез двуспиральной ДНК следует за синтезом односпиральной ДНК, которая является матрицей для синтеза двуспиральной ДНК. Односпиральная ДНК дуплицируется (до или после того, как она сойдет с РНК-матрицы) и образует двунитевую молекулу ДНК.

Основное количество вирусной ДНК 95% синтезируется в течение 1-го часа инфекции. Для ее образования не требуется синтеза клеточных ферментов de novo. Наибольшей матричной активностью обладает 70S РНК, хотя 4S, 5S и 7S РНК также транскрибируются в полимеразной реакции.

Судьба родительских РНК, точно так же как и функция РНКазы Н в этом процессе, до сих пор неизвестна. Можно только предполагать, что РНКаза Н после синтеза ДНК — РНК-гибрида переваривает РНК-матрицу, что является необходимым условием для последующего синтеза двуспиральной ДНК.

Принципиально важным является вопрос о том, считывается ли весь геном вирусной РНК in vitro при синтезе двуспиральной вирусспецифической ДНК или при этом транскрипция идет лишь с определенного участка вирусного генома. Вначале методом реассоциации было показано, что двуспиральная ДНК, синтезированная на матрице 70S РНК вируса саркомы Рауса, состоит из двух типов молекул, одни из которых содержат 5% последовательностей вирусного генома и транскрибируются главным образом с определенных участков РНК (быстро реассоциирующиеся молекулы), другие — 30% (и более) генома (медленно реассоциирующиеся молекулы).

Эти факты сразу же поставили под сомнение возможность использования 3Н-ДНК-продукта для выявления вирусспецифических нуклеотидных последовательностей в клетках. Однако вскоре выход был найден благодаря использованию актиномицина D, который, как известно, не влияет на синтез ДНК на РНК-матрице, но блокирует второй этап реакции — синтез двуспиральной ДНК.

Следовательно, в системе с актиномицином D синтезируются только односпиральные минус-нити вирусной ДНК, которые, как оказалось, содержат все последовательности нуклеотидов, входящие в вирусный геном. Например, подобраны условия, позволяющие осуществлять полную транскрипцию РНК RSV с помощью обратной транскриптазы AMV (Darlix et al., 1977).

Анализ процесса свидетельствует о том, что инициация синтеза ДНК in vitro с помощью полимеразы AMV происходит на 3 — 4 участках РНК RSV.

В опытах по гибридизации вирусной 70S РНК с ДНК, синтезированной в отсутствие актиномицина D, показано, что, хотя все последовательности вирусного генома транскрибируются в полимеразной реакции, количество копий, получаемых с разных участков генома, различно.

Таким образом, вирусные ДНК-копии могут содержать информацию практически всего вирусного генома.

«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Количественные определения в опытах с использованием импульсной метки, а также данные, полученные с ингибиторами белкового синтеза и канаванином, говорят о том, что протеолитическое расщепление Рrlа + b является первым путем образования промежуточных предшественников обратной транскриптазы — PrRTl, 2 и 3. Вместе с тем неясно, играет ли какую-то роль этот путь расщепления в образовании продуктов gag-гена….

Определен полный аминокислотный состав р30 вирусов С-типа мышей, кошек, крыс и обезьян, свидетельствующий о сходстве этих белков по этому критерию. Белок р30 богат остатками аминокислот с полярными боковыми цепями (лизин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты или их амиды), беден цистеином, метионином, гистидином и изолейцином. Исследование первых 30 остатков с NН2-конца р30 показало высокий уровень родства…

Основная масса вирусспецифических полипептидов синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах, а часть находится во фракции свободных полирибосом, где и происходит их синтез. Методом иммунопреципитации пептидов удалось определить размеры этих полирибосом — 350S. Эта величина свидетельствует о том, что вирусные мРНК транслируются на полирибосомах, состоящих из 12 монорибосом. На полирибосомах такого размера могут транслироваться мРНК с молекулярной массой…

Продолжая эти исследования, Pawson и соавт. (1977) установили, что в бесклеточной белоксинтезирующей системе (использовали либо асцитные, либо клетки L) белок, синтезируемый геномной 30 — 40S-PHK RSV, имел молекулярную массу 76 000 и осаждался антисывороткой к разрушенному вирусу и р12, р30, но не антисывороткой к gp85. Смотрите — Трансляция РНК онкорнавирусов in vivo Следовательно, Рr76 является…

В клетках, зараженных R — MuLV, идентифицировано несколько быстрометящихся нестабильных высокомолекулярных белков: Prla±b (с массой около 200 000) — предшественник р30, р15, р12, р 10 и обратной транскриптазы; Prla±b (с массой около 90 000) — предшественник gp69/71, p 15(Е) и р12(Е); Рr3 (с массой около 80 000) и Рг4 (с массой около 70 000) —…